一种定制的辅酶A连接酶-N-酰基转移酶级联反应用于DNA上酰胺键形成，实现广泛的底物范围

《Nature Catalysis》：A tailored CoA ligase–N-acyltransferase cascade for on-DNA amide bond formation gives access to broad substrate scope

　　

DNA编码化学库（DNA-encoded chemical library, DEL）技术是早期药物发现中的一种强大工具。尽管在工业界和学术界广泛应用，但在生成高质量和化学多样性的DEL方面仍存在挑战。构建模块掺入的低产率、有限的选择性以及最重要的是，苛刻反应条件导致的DNA损伤，损害了文库质量，降低了亲和筛选中的信噪比，并最终阻碍了药物发现。在此，研究人员展示了可以利用定制的酶在温和条件下有效构建DNA上的分子多样性。针对酰胺键形成，研究人员设计了一种由互补的辅酶A连接酶（coenzyme A ligases, CoA ligases）和理性定制的N-酰基转移酶（N-acyltransferases, NATs）组成的级联反应，以实现DNA上广泛的酰胺底物范围（>120个实例），并在过程中识别出优化生物催化剂DNA相容性的结构元件。将酶促级联反应与化学合成相结合，构建了一个多样化的DEL，且未对DNA条形码造成损伤，突显了生物催化剂在早期骨架构建和后期功能化中的适用性。

### 论文解读：定制的CoA连接酶–N-酰基转移酶级联反应用于DNA上酰胺键形成

#### 研究背景与问题

DNA编码化学库（DNA-encoded chemical library, DEL）技术是早期药物发现的重要平台，通过迭代的“分裂-合并”组合合成生成规模达10⁶至10⁹成员的文库，并利用亲和筛选识别靶蛋白的配体。然而，传统DEL合成面临核心挑战：DNA标签对反应条件极为敏感，强酸、金属催化剂等可能导致脱嘌呤、碱基颠换或DNA断裂，导致文库质量下降、信号噪声比降低，最终限制药物发现效率。此外，化学酰胺键形成常需大量过量的底物和偶联试剂，且产率不稳定。为克服这些限制，研究人员提出利用生物催化（biocatalysis）在温和条件下构建DNA上的分子多样性，以保留DNA完整性并实现高选择性、高产率。本研究聚焦于酰胺键形成这一药物化学中的关键反应，探索由辅酶A连接酶（CoA ligases, CLs）和N-酰基转移酶（N-acyltransferases, NATs）组成的酶促级联反应在DNA上的应用，旨在开发定制的生物催化剂，拓宽底物范围并提高DNA相容性。

#### 关键技术方法

研究人员采用以下主要技术方法：
1. **酶筛选与表达**：从文献中选取7种野生型CoA连接酶和NAT，基于底物范围、来源和序列多样性，克隆至pET28b载体并在大肠杆菌（*Escherichia coli*, *E. coli*）BL21(DE3)中表达。
2. **DNA偶联底物构建**：通过化学偶联将不同长度和性质的连接子（C6、C12、TEG）连接至14-mer寡核苷酸（序列：GGA CGG GCG GCA CA-3'）的5'端，并偶联至胺类底物，合成单链或双链DNA标签。
3. **酶工程与定向进化**：对NAT 42GmAT进行结构引导的理性设计，包括环交换（loop swap）和位点饱和突变（NNK文库），以提升DNA上活性。
4. **活性检测与动力学分析**：使用液相色谱-质谱联用（LC-MS）监测产物形成，采用孔雀绿（Malachite Green）比色法检测CoA连接酶对羧酸的活化效率，并通过定量PCR（qPCR）评估DNA完整性。
5. **计算建模**：利用Boltz-2和Boltz-2x进行共折叠模拟，分析酶与DNA标签的相互作用，使用NCIPLOT和pyKVFinder分析非共价相互作用和结合口袋体积。

#### 研究结果

**1. 酶选择与底物范围评估**
研究人员筛选了7种CoA连接酶和NAT，发现来自*Pseudomonas aeruginosa*的05PaAT和来自*Gibberella moniliformis*的42GmAT在级联反应中成功催化DNA上酰胺键形成。通过优化连接子类型，发现C12连接子（疏水长链）效果最佳，单链DNA（ssDNA）标签优于双链DNA（dsDNA），且酶对嘌呤碱基（鸟嘌呤>腺嘌呤）的偏好高于嘧啶碱基。

**2. DNA标签对酶活性的影响**
实验表明，单链DNA标签与酶的相互作用（如Y229与鸟嘌呤的π-π堆积）可促进底物定位，而双链DNA因空间位阻降低活性。计算建模（Boltz-2x）和NCIPLOT分析支持这一结论。

**3. 42GmAT工程改造以提升DNA上性能**
通过结构分析，研究人员识别出42GmAT的螺旋-环-螺旋基序（helix-loop-helix motif，残基136-150）对DNA结合至关重要。环交换实验显示，将42GmAT的该基序引入05PaAT可提升活性17倍。进一步对隧道入口的4个位点（M139、P141、S178、M179）进行饱和突变，筛选出M139Y、M139F和M179W等变体，在DNA上胺底物f反应中催化效率（k_cat/K_m）提升超过150倍（野生型：7.93×10^-2 min^-1 mM^-1；M139Y：4.32×10^-1 min^-1 mM^-1）。计算建模显示M139Y突变使底物更易采取催化活性构象。

**4. 羧酸底物范围**
利用孔雀绿比色法筛选236种羧酸，发现CoA连接酶ipfF（偏好芳香酸）和LcCL（偏好脂肪酸）具有互补底物范围，共激活73种羧酸，包括22种化学偶联困难底物。优化条件后，级联反应（ipfF或LcCL与42GmAT M139Y）成功将37种羧酸与DNA上胺f偶联，转化率高达98%。

**5. 酶促构建DEL**
在多功能骨架（含两个胺基）上，42GmAT M139Y可选择性修饰邻近DNA的胺基，转化率92-99%。随后，研究人员化学安装8种羧酸（第一类构建块，BB1），再通过酶促级联反应引入9种羧酸（第二类构建块，BB2），构建了含72个化合物的化学-酶促DEL，平均转化率>91%。

**6. DNA完整性**
通过qPCR检测，所有酶促反应后DNA的可扩增性未降低，表明DNA标签完整无损。T4 DNA连接酶介导的连接效率也证实DNA未受损。

#### 总结与讨论

研究人员开发的定制的CoA连接酶–N-酰基转移酶级联反应为DNA上酰胺键形成提供了高效、温和的方法，实现了超过120个实例的广泛底物范围，平均转化率>91%，且完全保留DNA标签完整性。结构引导的工程改造揭示了酶与DNA标签的相互作用可被利用以提升催化效率，并发现DNA条形码可作为额外的底物识别元件。该研究展示了生物催化剂在DEL早期骨架构建和后期功能化中的适用性，为其他反应类型的酶促DEL合成铺平了道路，有望加速新药发现。

**研究结论**（翻译原文结论部分）：
“生成成功DEL的关键因素是所选择的转化必须保持DNA标签的完整性，同时为广泛的底物实现高转化率。不幸的是，合成化学中常规使用的反应条件，如低pH或金属催化剂的应用，可能导致脱嘌呤和碱基颠换或促进DNA切割。在此背景下，酶正成为DEL反应工具包中有吸引力的补充。尽管乍看之下，庞大的DNA标签可能被视为酶底物接受的障碍，但我们日益增强的利用不同方法按需发现、设计和定制蛋白质的能力正在帮助应对这一挑战，从而产生高度混杂的催化剂，可用于早期和后期文库生成。事实上，我们推测DNA条形码可以作为额外的底物识别元件，并且在适当工程化的酶中可以促进催化。这一见解不仅对DEL合成重要，还可能影响DEL筛选，因为连接子-DNA构建体可能影响结合亲和力。最后，我们对用于DEL构建的定制酶级联反应的研究表明，利用定制酶进行DEL合成能够以显著较低的底物过量实现广泛的底物范围内优异的反应产率，为将生物催化也用于其他反应类型铺平了道路。最终，由此产生的多样化和高质量的DEL可能加速我们发现新药的能力。”