综述：基萨努尔森林病：疫苗开发与评估的可行策略

《The Lancet Regional Health - Southeast Asia》：Kyasanur Forest Disease: feasible strategies for vaccine development and evaluation

　　

基萨努尔森林病（KFD）是一种蜱传人畜共患感染，在印度某些地区呈地方性流行，地理分布不断扩展，并在西高止山脉依赖森林的人群中反复出现局部暴发。2022年，甲醛灭活KFD疫苗的停用造成了预防方面的关键缺口。新的候选疫苗正在开发中，但由于疾病发病率低，且暴发具有聚集性和不可预测性，传统的3期有效性试验难以实施。KFD疫苗评估可能需要替代的监管途径。初始步骤包括在实验室确诊的KFD患者中开展研究，以识别候选保护相关性标志物。这些免疫标志物随后可在帽猴攻毒模型中评估，以确定其与感染和临床疾病保护之间的关联，并定义保护性免疫阈值或复合免疫终点。在研究人员看来，3期免疫桥接研究可随后评估针对预设免疫阈值的血清应答率，为疫苗有效性和监管决策提供支持性证据。上市后研究可评估实际疫苗有效性，并帮助优化疫苗接种策略。疫苗部署应优先考虑高风险人群，并与KFD的季节性传播模式保持一致。这一框架可能为KFD疫苗在流行地区的部署提供一条可行路径。

引言
基萨努尔森林病（KFD）是一种新发人畜共患感染，由黄病毒科（Flaviviridae）的KFD病毒引起，通过受感染的蜱虫叮咬传播给人类。KFD于1957年在卡纳塔克邦希莫加县的一次伴有出血表现的发热性疾病暴发中首次被识别。几十年来，KFD主要局限于卡纳塔克邦的四个县，导致散发病例和局部暴发，尤其是在经常接触森林环境的人群中。然而，自2006年以来，KFD在地理上不断扩展，已在卡纳塔克邦多个县以及邻近邦（包括喀拉拉邦、马哈拉施特拉邦、果阿邦和泰米尔纳德邦）报告。每年约400-500人感染KFD，暴发发生在局部地区，病死率为2-12%。传统的控制措施如使用蜱虫驱避剂、穿防护服、在森林区域施用杀螨剂等难以持续实施，因此疫苗接种成为一项重要的预防策略。

由印度医学研究理事会（ICMR）国家病毒学研究所开发的甲醛灭活KFD疫苗曾用于卡纳塔克邦四个流行县的KFD预防。该疫苗对7至65岁个体接种两剂，间隔一个月，并在初次接种后6-9个月内推荐加强剂量，且在该地区最后确认KFD病例后连续五年重复接种。1990-1992年进行的一项现场评估报告称，一剂疫苗的有效性为82.2%（95% CI: 69.8-89.6），两剂后为94.5%（95% CI: 89.7-97.1）。然而，后续研究显示有效性较低，与未接种个体相比，接受一剂疫苗的个体有效性为62.4%（95% CI: 26.1-80.8），接受两剂加一剂加强的个体为82.9%（95% CI: 71.3-89.8）。此外，由于需要多次加强剂量以及对免疫后不良事件的担忧，疫苗覆盖率仍然较低。2022年10月，卡纳塔克邦公共卫生部因不符合良好生产规范且疫苗效价低，停止使用早前的KFD疫苗。

目前，数种KFD候选疫苗正在开发和评估中。两种表达KFDV前体膜（prM）和包膜（E）蛋白的活减毒水疱性口炎病毒-埃博拉（VSV-EBOV）载体疫苗（分别包含全长或截短EBOV糖蛋白）被证明可保护小鼠免受致命KFD病毒攻击。在猪尾猕猴中，单次肌肉注射表达全长EBOV GP和KFDV prM和E蛋白的VSV载体疫苗被发现安全，并引发了强烈的体液和细胞免疫应答。尽管结果令人鼓舞，但由于疫苗中含有EBOV蛋白的担忧，该候选疫苗未进入临床试验。由海得拉巴印度免疫学有限公司开发的全病毒BPL灭活KFD疫苗在小动物研究中被证明安全且具有免疫原性。两剂疫苗在Balb/c小鼠模型中引发了强烈的IgG应答、升高的中和抗体以及T细胞细胞因子应答，并对KFDV攻击提供了完全保护。经中央药物标准控制组织（CDSCO）批准，一项首次在健康印度成年人（18-49岁）中进行的随机、双盲、安慰剂对照1期研究已启动。

KFD疫苗有效性试验的挑战
随着新的KFD候选疫苗进入临床评估，现在正是定义监管批准和程序化部署的证据路径的时机。传统疫苗许可路径包括1期（安全性和免疫原性）、2期（免疫原性、安全性、剂量探索和初步有效性）、3期（确定性有效性、安全性、批次一致性，从而获得监管批准）以及4期（上市后安全性和有效性）研究。然而，为KFD疫苗开展个体随机3期试验可能具有挑战性。对于其他虫媒传染病如登革热，由于传播模式可预测且疾病发病率较高，大规模个体随机临床试验是可行的。相比之下，KFD的发病率较低。该疾病通常以地理聚集和不可预测的暴发形式出现。风险人群分布分散。因此，个体随机有效性试验需要非常大的样本量和较长的随访期，这在操作或财务上可能不可行。

可以考虑替代试验设计。例如，埃博拉疫苗Ervebo（一种重组水疱性口炎病毒载体活疫苗）的有效性是在西非埃博拉疫情期间通过集群随机设计证明的。在该试验中，确诊病例的接触者及其接触者被视为集群（环），然后随机接受即时或延迟疫苗接种。然而，这种方法可能不适用于KFD，因为KFD通过受感染的蜱虫叮咬传播，且无记录的人传人现象。一种涉及高风险森林暴露个体（如森林工人、柴火采集者和放牧者）的改良集群试验设计可能是可行的。然而，此类试验仍可能面临实际限制，因为个体对受感染蜱虫的暴露程度差异很大，且KFD暴露风险受行为而非仅地理因素强烈影响。此外，暴发通常涉及多个分散的村庄，总体病例数可能仍然太少，无法可靠测量疫苗有效性。

疫苗开发的可行策略
当传统的人体有效性试验难以开展时，可以考虑基于动物保护数据和人体免疫原性的监管路径。减毒基孔肯雅病毒（CHIKV）疫苗VLA1553/Ixchiq的开发为KFD疫苗开发提供了相关范例。

对于基孔肯雅，来自自然感染和临床前研究的证据表明，中和抗体是防止CHIKV感染和疾病的最可能介质。为了建立血清学保护替代终点，将来自具有不同中和抗体滴度疫苗接种个体的血清被动转移给CHIKV初治非人灵长类动物，随后用野生型CHIKV进行攻毒。然后，在攻毒前立即测量的μPRNT50滴度与病毒学和临床结果相关联。转移免疫血清可保护动物免受病毒血症、发热、其他临床症状以及组织中病毒持续存在的影响。以血浆中无可检测的CHIKV RNA为终点，选择μPRNT50滴度≥150作为保守的血清学保护替代终点。该阈值进一步得到人类血清流行病学数据的支持。在3期研究中，使用免疫原性终点（包括血清应答率和达到预设抗体滴度阈值的参与者比例）替代临床有效性终点。随后基于免疫桥接数据授予监管批准。

类似的免疫桥接路径可用于KFD疫苗的评估。第一步是在实验室确诊的KFD患者中识别候选保护性免疫相关性标志物。现有证据表明，KFD病毒从血液中清除与KFDV特异性IgG抗体的出现和CD8⁺ T细胞活化峰值同时发生。在一项纵向研究中，KFDV特异性IgG在发病后第7-8天出现，病毒清除与IgG的出现相关，同时在急性感染期间也观察到强烈的CD8⁺ T细胞活化。Kaushal等人还报告了康复KFD病例中显著的淋巴细胞增殖反应和分泌IFN-γ的CD4⁺ 和CD8⁺ T细胞的高频率。在一项对72名KFD患者的前瞻性随访研究中，从发病后第5天至最近一次可用样本（474天）均检测到KFDV特异性IgG，尽管该研究评估的是结合抗体而非功能性中和滴度。早期血清学研究也证明了KFD后KFDV中和抗体的持久性。然而，自然感染后KFDV特异性中和抗体的动力学、幅度和持久性尚未通过标准化PRNT或微量中和试验得到充分表征。

尽管体液和细胞介导的免疫应答可能都有助于控制KFD感染，但细胞介导的免疫难以作为大型3期免疫桥接研究的主要终点，因为细胞检测复杂、资源密集且在不同实验室间标准化程度较低。因此，在未来的KFD免疫相关性研究中，KFDV特异性中和抗体滴度可作为领先的候选体液标志物优先考虑。

一旦确定了保护相关性标志物，候选免疫标志物可在相关动物攻毒模型中进行测试，并在可行时通过被动转移实验，以确定它们是否能预测对病毒血症和临床疾病的保护。帽猴（Bonnet macaques）是建立和验证候选保护相关性标志物的理想模型。它们会产生类似于人类KFD感染的病毒血症和病理学发现，使其成为疫苗评估的相关转化模型。在帽猴中，被动转移的免疫血清可根据预设的攻毒终点（如病毒血症、发热或临床疾病、病理学和存活率）进行评估。

一旦定义了KFD特异性保护阈值并经过验证，3期临床试验可评估达到该阈值的疫苗接受者比例，并辅以几何平均中和抗体滴度、应答持久性和选定的细胞介导免疫标志物。此外，可将疫苗诱导的中和抗体滴度与实验室确诊KFD感染者中观察到的滴度进行比较，为潜在保护性免疫应答提供支持性证据。

在印度，类似的基于免疫原性的监管方法已被使用。JENVAC（乙型脑炎灭活疫苗）的许可主要基于免疫原性数据，使用由中和抗体滴度≥1:10定义的既定保护相关性，而不依赖传统的有效性试验。这一经验支持了以下可行性：一旦确定并充分验证了候选保护性免疫阈值，可以考虑将免疫桥接方法用于KFD疫苗评估。

在动物模型中建立的保护性免疫阈值可能无法完全预测现场条件下对人类的保护作用。KFDV毒株的地理变异和暴露强度的异质性也可能影响疫苗性能。在许可后，持续监测疫苗接受者并生成疫苗有效性的真实世界证据至关重要。1990-1992年间，Dandawate等人在卡纳塔克邦三个流行县（希莫加、北卡纳达和奇克马加卢尔）的284个村庄中，对超过20万名7-65岁居民进行了甲醛灭活KFD疫苗的现场评估。在这些村庄建立了KFD监测，从而能够估计疫苗有效性。在流行地区建立类似的村庄队列，同时记录疫苗接种状况并加强KFD病例和免疫后不良事件（AEFI）的监测，可生成关于疫苗安全性和程序化条件下有效性的宝贵证据。此外，在流行县建立专门的AEFI监测系统，由县级AEFI委员会及时调查严重不良事件，将是至关重要的。

对接种人群进行长期随访对于评估保护持久性（通过抗体持久性评估以及真实世界疫苗有效性的估计）非常重要。在流行县许可后加强KFD监测，并在此监测平台内嵌入分析性研究，也可能促进疫苗有效性的上市后评估。印度疫苗接种状态记录不充分一直是一个挑战，利用U-WIN数字平台记录疫苗接种情况可显著解决这些限制。在这种情况下的一个有用分析方法是检测阴性病例对照设计，其中将实验室确诊病例的接种状态与出现疑似症状但KFD检测阴性的个体进行比较。检测阴性研究的有效性取决于标准化的病例定义、统一的实验室检测方案以及接种和未接种个体之间相似的求医行为。在未来的KFD暴发期间，通过比较病例和对照的接种状态，也可以估计疫苗有效性。

规划KFD疫苗的程序化部署也至关重要。与早前的KFD疫苗类似，考虑到KFD病例的年龄分布，候选疫苗可提供给流行地区7-65岁个体。高风险人群，包括依赖森林的社区、部落人群以及职业群体如森林工人、放牧者和柴火采集者，应优先接种。

随着新的KFD候选疫苗进入临床开发阶段，规划后续评估至关重要。鉴于疾病发病率低且暴发不可预测，传统的有效性试验可能不可行，使得免疫桥接成为疫苗许可的务实路径。该方法包括在KFD患者中识别候选保护相关性标志物，在动物攻毒研究中验证保护性免疫阈值，并在3期试验中评估针对预设阈值的血清应答率。上市后有效性评估将提供关于真实世界疫苗有效性的额外证据。强调疫苗接种、避免蜱虫叮咬和早期就医的社区参与对于补充疫苗接种计划至关重要。