从多奈哌齐连接查耳酮库中发现的强效选择性MAO-B抑制剂及其有前景的抗帕金森活性

《Drug Development Research》：Discovery of a Potent and Selective MAO-B Inhibitor From a Donepezil-Linked Chalcone Library With Promising Antiparkinsonian Activity

　　

研究人员通过微波辅助Claisen-Schmidt缩合高效合成了一个包含19个多奈哌齐连接查耳酮(Donepezil-Linked Chalcones, DLCs)的聚焦库，并随后对其针对胆碱酯酶(AChE和BuChE)以及单胺氧化酶(MAO-A和MAO-B)的抑制活性进行了分析。DLCs表现出强效且选择性的MAO-B抑制，IC50值范围为0.019至18.98 μM，而对MAO-A的活性为中等至较低(IC50 = 0.81至 > 20 μM)。在受测DLCs中，DLC9和DLC14显示出最高的MAO-B抑制潜力，IC50值分别为0.054 ± 0.004 μM和0.019 ± 0.0015 μM，且具有高选择性指数(分别 > 370和 > 1052)，而DLC12显示出显著的MAO-A抑制(IC50 = 0.81 ± 0.035 μM)。动力学和可逆性研究表明，选定的两个先导DLC(DLC9和DLC14)作为混合型可逆MAO-B抑制剂发挥作用，Ki值分别为20.0 ± 2.83 nM和10.0 ± 2.82 nM。此外，AChE抑制活性的IC50值范围为5.40至 > 40 μM，而BuChE抑制活性的IC50值范围为4.30至 > 40 μM。DLC6显示出最佳的AChE抑制潜力，IC50值为5.40 ± 0.29 μM，而DLC13显示出有效的BuChE抑制潜力，IC50值为4.30 ± 0.89 μM。在hMAO-A和hMAO-B上进行的分子对接研究表明，DLC14在hMAO-B的芳香笼内建立了有利的π–π堆积，并沿底物腔维持了互补的疏水接触，而DLC6由于乙氧基取代基的空间干扰缺乏这一关键相互作用。在三个最强效的MAO-B抑制剂(DLC2、DLC9和DLC14)中，DLC2在大鼠和人肝微粒体中表现出最有利的微粒体稳定性，半衰期最长且内在清除率最低，而DLC14在大鼠和人肝微粒体中显示出可比的代谢特征。实验血脑屏障(BBB)渗透性测定因化合物与膜相互作用而受阻；然而，计算机(in silico)预测表明所有三个候选物均具有满意的口服生物利用度和脑渗透性。在MPTP诱导的帕金森样大鼠模型中，选择性MAO-B抑制剂DLC14和非选择性抑制剂DLC6在旷场、杆、棒、转棒和强迫游泳测试中显著改善了运动缺陷和行为损伤，直至第28天观察到渐进性改善。值得注意的是，DLC14始终优于DLC6，并显示出与司来吉兰(Selegiline)相当的功效特征，突显了其作为抗帕金森药物的潜力。这些结果表明DLC14是强效且选择性的MAO-B抑制剂，可作为治疗帕金森病(PD)等神经退行性疾病的候选物。

该研究发表于《Drug Development Research》。目前神经退行性疾病尤其是帕金森病（PD）发病率随老龄化持续上升，临床缺乏能改变疾病进程的疾病修饰疗法，现有治疗多以缓解症状为主。PD病理涉及多巴胺能神经元丢失、氧化应激、神经炎症等多因素交织，单一靶点策略受限。多靶点定向配体（MTDLs）通过分子杂交互补药理特征成为可行方向。基于此，研究人员设计并合成多奈哌齐连接查耳酮（DLC）库，旨在整合多奈哌齐的乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制潜力与查耳酮骨架的MAO-B抑制能力，开发兼具胆碱酯酶与MAO调控的多功能抗PD候选分子，评估其酶学、药代及体内抗帕金森活性。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：通过微波辅助Claisen-Schmidt缩合合成19个DLC化合物并用FT-IR、NMR、HRMS表征；采用酶活抑制实验测定对MAO-A、MAO-B、AChE、BuChE的IC₅₀与选择性指数；通过Lineweaver-Burk作图与透析法分别进行酶动力学与可逆性分析；利用AutoDock 4.2对hMAO-A（PDB:2BXR）、hMAO-B（PDB:2BYB）、hAChE（PDB:7D9O）、hBuChE（PDB:7AWH）进行分子对接；使用大鼠与人肝微粒体评价代谢稳定性，采用PAMPA与MDCK-MDR1评估血脑屏障（BBB）渗透性（因膜结合干扰辅以Deep-PK服务器预测）；选用体重200–220 g成年Wistar大鼠，通过MPTP（30 mg/kg，腹腔注射，连续5天）建立帕金森样模型，设置阳性对照（生理盐水、司来吉兰10 mg/kg）与治疗组（DLC6、DLC14各10 mg/kg，灌胃），在Day 7、14、28通过旷场、杆、棒、转棒、强迫游泳测试评价运动与行为改善。

2 Results and Discussion

2.1 Design Strategy and Chemistry

研究人员基于多奈哌齐的5,6-二甲氧基-1-茚满酮AChE结合域与含杂环（哌啶）查耳酮的MAO-B抑制药效团，通过连接策略构建DLC系列。采用微波辅助Claisen-Schmidt缩合，在100°C下由4-(1-哌啶基)苯甲醛与不同取代苯乙酮在乙醇/NaOH中反应获得DLC1–19，产率18%–80%。结构经FT-IR确认α,β-不饱和羰基（1626–1659 cm^?1），¹H NMR显示烯键反式（E）构型双峰，¹³C NMR共轭羰基碳在δ 188–201 ppm，HRMS验证分子量，系统改变茚满酮片段取代基（单、双、三取代及甲基二氧基）以探讨构效关系。

2.2 Enzyme Inhibition Assay

2.2.1 Inhibitory Activities Against Monoamine Oxidase Enzymes (MAO-A/B)

初筛（10 μM）显示DLC3、DLC12对MAO-A残余活性<50%，DLC1–3、DLC9、DLC14、DLC15对MAO-B无残余活性。浓度依赖性测定表明MAO-B IC₅₀为0.019–18.98 μM，其中DLC14（0.019 ± 0.0015 μM）与DLC9（0.054 ± 0.004 μM）最强，选择性指数分别 > 1052与 > 370；MAO-A IC₅₀为0.81– > 20 μM，DLC12最强（0.81 ± 0.035 μM）。DLC14效力与参考药沙芬酰胺（Safinamide, 0.021 ± 0.002 μM）相当。

2.2.2 Inhibitory Activities Against Acetylcholinesterase (AChE) and Butyrylcholinesterase (BuChE)

40 μM初筛中DLC3、DLC5、DLC6对AChE有潜力，DLC3、DLC5、DLC11、DLC13对BuChE强效。IC₅₀显示AChE为5.40–7.53 μM（DLC6最佳5.40 ± 0.29 μM），BuChE为4.30–6.46 μM（DLC13最佳4.30 ± 0.89 μM），整体胆碱酯酶抑制为中等强度。

2.2.3 Structure-Activity Relationships (SAR) Analysis

A环取代模式显著影响MAO-B：3,5-二甲氧基（DLC14）优于2,5-二甲氧基（DLC9），间位甲氧基优于对位，DLC14较对位单甲氧基DLC2增强5倍，DLC9较间位单甲氧基DLC1增强7.8倍。AChE抑制中，对位乙氧基（DLC6）较对位甲氧基（DLC3）提升1.2倍，表明细微链长变化影响靶标亲和力与选择性。

2.2.4 Enzyme Kinetic Studies

以苄胺为底物，对DLC9与DLC14做MAO-B动力学，Lineweaver-Burk图呈混合型抑制；二次作图得K_i分别为20.0 ± 2.83 nM（DLC9）与10.0 ± 2.82 nM（DLC14），证实与酶活力位点可逆且强效结合。

2.2.5 Reversibility Studies

约2倍IC₅₀浓度下透析显示，DLC14残余活性从26.12%（未透析）恢复至63.19%（透析后），DLC9从29.23%恢复至73.03%，与可逆参照沙芬酰胺（17.00%–80.33%）相似，区别于不可逆参照帕吉林（Pargyline, 17.01%–18.90%），确认为可逆MAO-B抑制剂。

2.2.6 Molecular Docking Studies

DLC14与hMAO-B对接显示3,5-二甲氧基苯环嵌入芳香笼（FAD、TYR398、TYR435），与TYR398形成π–π堆积，其余部分沿狭窄隧道与LEU171、PHE168、ILE199、ILE316、ILE316等残基疏水作用；DLC6因对位乙氧基位阻被推出芳香笼，失去π–π堆积导致亲和力下降。与hMAO-A对接时DLC14未占据芳香笼，通过疏水与TYR407氢键作用。DLC6与hAChE对接显示哌啶苯环与TYR337 π–π堆积，羰基氧与PHE295氢键，乙氧基苯环与外周阴离子位点疏水；与hBuChE为反向取向，羰基与SER198、HIS438氢键，乙氧基苯环与HIS438 T型作用，整体弱于AChE解释较高IC₅₀。

2.2.7 In Vitro Metabolic Stability and Permeability Studies

大鼠与人肝微粒体显示DLC14半衰期t_1/2约4.5 min，清除率CL_int 301–310 μL/min/mg-protein，种属间相似；DLC2最稳定（人t_1/2 8.15 min，CL_int 172）；DLC9不稳定（人t_1/2 1.05 min，CL_int 1346）。BBB渗透PAMPA与MDCK-MDR1因化合物与膜黏附失败，计算机Deep-PK预测三者均有良好口服生物利用度与BBB渗透性。

2.2.8 Pharmacology

在MPTP大鼠中，DLC14（选择性MAO-B抑制剂）与DLC6（非选择性）10 mg/kg处理至Day 28。旷场测试：DLC14与DLC6均渐进提升穿线数与探索行为、降低不动时间与理毛次数，Day 14较阴性对照显著改善（p < 0.0001），效果顺序为司来吉兰 > DLC14 > DLC6。杆测试：T-turn与T-total渐进缩短（p < 0.0001），Day 14显著优于阴性对照。棒测试：DLC14催化时间渐进下降（p < 0.0001），DLC6在Day 14–28显著下降。转棒测试：跌落潜伏期渐进延长（p < 0.0001）。强迫游泳：游泳时间渐进增加（p < 0.0001）。尽管DLC6与DLC14 MAO-B效力差约1000倍，体内效果相近，归因于DLC6非选择性MAO-A/B抑制可能缓解抑郁样症状。整体DLC14在运动、协调、情感行为改善上优于DLC6，接近司来吉兰。

讨论部分指出，DLC库通过特定甲氧基取代（2,5-与3,5-位）显著提升MAO-B效力与选择性，DLC9与DLC14为纳摩尔级可逆混合型抑制剂，胆碱酯酶抑制中等。分子对接阐明芳香笼π–π堆积对MAO-B抑制的关键作用，DLC14结合优于DLC6。代谢稳定性中DLC2最优，DLC14种属差异小；BBB实验受限但计算预测支持CNS暴露。体内证实DLC14为强效抗帕金森候选，选择性MAO-B抑制在改善帕金森症状上具有药理优势。

结论部分翻译如下：

总之，研究人员设计并通过微波辅助Claisen-Schmidt缩合合成了一个包含19个查耳酮分子（DLCs）的聚焦库，并全面评估了它们对MAO-A、MAO-B、AChE和BuChE的抑制谱。构效关系分析表明，MAO-B的效力和选择性通过A环上特定的甲氧基取代（特别是2,5-和3,5-位）显著改善，而MAO-A显示最小活性。DLC9和DLC14是该系列中最强的MAO-B抑制剂，纳米摩尔IC₅₀值分别为54 ± 4 nM和19 ± 1.5 nM，且极高选择性指数（分别 > 370和 > 1052）。动力学表征与可逆性研究确认两者均为混合型可逆抑制剂，K_i值分别为10.0 ± 2.82 nM和20.0 ± 2.8 nM，证实与酶活性位点强且特异的相互作用。相反，胆碱酯酶抑制为中等，DLC6和DLC13分别显示最高AChE和BuChE活性。综上，这些发现确立DLC9和DLC14为强效选择性MAO-B抑制剂，为帕金森病（PD）等神经退行性疾病的治疗药物提供有前景的构建模块，并显示策略性甲氧基取代对调控酶选择性及活性的重要性。对接分析强调芳香笼占据和与TYR残基π–π堆积作用在主导MAO抑制效力中的作用，DLC14较DLC6（尤其对hMAO-B）显示更优结合轮廓。DLC2为代谢最稳定衍生物，而计算ADME分析支持该系列潜在CNS暴露，尽管渗透性评估存在实验局限，需进一步优化以平衡代谢稳定性与可靠脑渗透特征。体内发现确立DLC14为有前景的先导候选物，具稳健抗帕金森活性，显著改善运动功能、运动协调、运动迟缓和情感行为，其优于非选择性类似物DLC6进一步强调选择性MAO-B抑制在管理帕金森症状中的药理优势。