《Life Sciences》：Patient-derived cornea organoids as drug repurposing models for aniridia-associated keratopathy
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摘要研究目的本研究旨在利用从患者来源的iPSCs培育的角膜类器官模型，探讨药物重新定位在疾病治疗中的有效性，并阐明无虹膜相关性角膜病（AAK）的病理生理机制。材料与方法研究采用为期90天的逐步分化方案，从无虹膜患者及健康对照者的iPSC细胞系中培育角膜类器官。随后通过组织学、免疫
摘要 研究目的 本研究旨在利用从患者来源的iPSCs培育的角膜类器官模型，探讨药物重新定位在疾病治疗中的有效性，并阐明无虹膜相关性角膜病（AAK）的病理生理机制。
材料与方法 研究采用为期90天的逐步分化方案，从无虹膜患者及健康对照者的iPSC细胞系中培育角膜类器官。随后通过组织学、免疫荧光、qPCR、西方印迹实验以及转录组分析对这些角膜类器官进行特征鉴定。此外，还测试了两种已知药物——度洛西汀和阿塔鲁伦，看它们是否能恢复角膜类器官中的PAX6蛋白表达。
主要发现 组织学分析显示，这些角膜类器官的结构与正常角膜组织相似。角膜上皮细胞、基质细胞以及内皮细胞的生物标志物检测均呈现阳性反应。AAK相关的角膜类器官则表现出与该疾病特征相符的表现，比如上皮细胞层变厚，同时PAX6、ΔNP63以及角膜蛋白基因的表达水平下降。在经过度洛西汀处理后的AAK1型类器官，以及经过阿塔鲁伦处理后的AAK2型类器官中，PAX6蛋白的表达水平有所上升。而AAK3型类器官对这两种药物均无反应，说明这类药物的作用并非针对特定突变。转录组分析结果显示，这些类器官已实现明显的角膜分化，且不存在视网膜或晶状体相关的特征。
研究意义 本研究利用iPSCs构建了针对AAK的患者特异性类器官模型，有助于了解不同突变的影响，以及药物重新定位后对PAX6蛋白功能的恢复作用。这些研究结果为先天性无虹膜疾病的个性化治疗提供了理论基础。
引言 无虹膜症（OMIM编号：
106210 ）是一种罕见的双侧先天性眼部疾病，其特征为虹膜部分或完全缺失[1]。这是一种影响多类眼部结构的疾病，包括虹膜、角膜、视网膜、黄斑以及视神经[2]，其发病率为每5万到10万人中有1例[3]。大约三分之二的无虹膜症病例属于常染色体显性遗传，其余则为散发病例[4]。无虹膜症还与WAGR综合征有关，这是一种涉及11号染色体p13区域PAX6和WT1基因的连续基因缺失疾病[5]。
PAX6是眼睛和神经系统发育过程中的关键转录因子，在无虹膜症的发病机制中起着核心作用[6][7]。该基因的半剂量不足会导致无虹膜相关性角膜病（AAK）的发生，这是一种进行性角膜疾病，若不加以治疗将会引发失明[8][9]。AAK在临床表现上与边缘干细胞缺乏症（LSCD）类似，都会出现角膜混浊、炎症以及结膜增生等症状[10]。目前LSCD与AAK之间的确切关联尚不明确，AAK的分子机制也尚未被完全解析。因此，建立具有生理相关性的疾病模型对于推进治疗策略的发展至关重要。
传统的体外角膜模型通常使用上皮细胞、内皮细胞以及基质细胞来构建[11][12]，但由于这类二维模型仅包含单一类型的细胞，无法体现疾病的复杂性。因此，由胚胎干细胞或诱导多能干细胞培育出的三维角膜类器官模型，能够更深入地揭示疾病的发病机制、发展过程以及药物测试的效果[13][14]。这类可自我组织的模型为研究和临床应用带来了新的希望。目前已有不少不同组织类型是通过诱导多能干细胞成功培育出来的[15][16][17][18][19][20][21][22]，也有研究证实，从人类诱导多能干细胞中可以培育出具有角膜生物标志物表达的三维角膜类器官[23][24]。后来Foster等人又开发出一种更为简单高效的方法，能够利用胚胎干细胞和iPSCs培育出结构更为复杂的角膜类器官[24]。这类类器官在解剖结构和功能特性上都与人类角膜极为相似，因此极具作为组织移植材料的潜力。此外，使用自体角膜类器官还有助于降低组织排斥反应的风险。
有研究表明，抗精神病药物度洛西汀属于5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂，它可以通过抑制MEK/ERK信号通路，有效恢复突变型边缘干细胞中的PAX6蛋白表达[25]。另一项研究则发现，阿塔鲁伦（PTC124）可以通过作用于提前终止密码子，帮助恢复眼部类器官中的PAX6蛋白表达[26]。目前，研究人员正在利用从三名具有不同基因突变的无虹膜症患者身上获取的iPSCs培育的角膜类器官，来测试这两种药物的效果。这类研究属于药物重新定位的研究范畴，旨在通过现有药物加快先天性无虹膜症的治疗进展。
随着诱导多能干细胞技术的发展，我们终于有机会构建出能够模拟人体自然组织和细胞在体外发育过程的珍贵模型，同时也便于深入理解各种疾病的发生机制[27]。在本研究中，我们利用携带不同PAX6突变的患者iPSCs培育出了AAK模型，通过这一模型，我们不仅了解了该疾病的发病机制，还评估了阿塔鲁伦和度洛西汀等药物在治疗无虹膜症方面的潜力。
章节摘录 伦理审批情况 本研究中使用患者来源的诱导多能干细胞，已获得土耳其高等教育、研究与创新部（MESRI；编号IE-2018-967）的伦理批准。这些细胞系随后已在人类多能干细胞登记库中注册，对应的编号分别为AAKIPSi001-A、AAKIPSi002-A和AAKIPSi003-A。所有参与研究的自愿患者都签署了知情同意书，而对照组的诱导多能干细胞则获得了相关机构审查委员会的伦理批准。
无虹膜症患者来源角膜类器官的培育过程 患者来源的iPSCs是从外周血单核细胞中提取的，随后通过仙台病毒载体进行重编程。此前已有研究展示了本研究所使用的患者来源细胞与健康对照细胞的相关特征[28][29]。通过Sanger测序技术，我们确定了这些iPSCs所携带的PAX6突变类型：AAK1型的突变包括c.697C>T、p.(Gln233*)杂合无义突变；AAK2型的突变为c.649C>T、p.(Arg217*)杂合无义突变；AAK3型的突变则是c.836G>A、p.(Trp279*)杂合无义突变（详见表1）。
讨论 本研究中使用的患者来源iPSCs中所存在的突变，会根据其在PAX6蛋白中的位置产生不同的分子效应，尤其是那些位于该蛋白功能区域内的提前终止密码子所引发的突变。PAX6蛋白中的Arg217*和Gln233*突变位于同源结构域，这一区域是PAX6发挥基因调控功能所必需的DNA结合区域。这类突变会导致异常转录本的产生，进而被无义介导的降解机制所清除，最终只能生成无功能的蛋白质。
结论 在本研究中，我们利用从无虹膜症患者身上获取的iPSCs培育出了角膜类器官，用于模拟AAK的疾病特征。通过对这些类器官的分析，我们发现它们具备AAK疾病的关键特征，比如角膜上皮层变厚，以及各类角膜生物标志物的表达水平存在差异。我们的研究结果进一步表明，PAX6基因的半剂量不足效应会因PAX6基因的不同突变类型以及突变发生的位置而存在差异。
CRediT作者贡献说明 Ali Can Koc： 负责原始稿件撰写、数据可视化、结果验证、研究工作以及数据整理。Gamze Kocak： 负责原始稿件撰写、数据可视化、结果验证、正式数据分析以及数据整理。Burak Kahveci： 负责原始稿件撰写、研究方法设计、正式数据分析以及数据整理。Adil Mardinoglu： 负责提供研究资源并参与研究工作。G?khan Karakülah： 负责稿件审阅与编辑、数据可视化以及正式数据分析。Canan Asl? Utine： 负责研究工作以及正式数据分析。Sinan Güven： 负责稿件审阅与编辑。
伦理审批情况 本研究中使用患者来源的诱导多能干细胞，已获得土耳其高等教育、研究与创新部（MESRI；编号IE-2018-967）的伦理批准。这些细胞系随后已在人类多能干细胞登记库中注册，对应的编号分别为AAKIPSi001-A、AAKIPSi002-A和AAKIPSi003-A。所有参与研究的自愿患者都签署了知情同意书，而对照组的诱导多能干细胞则获得了相关机构审查委员会的伦理批准。
资金支持情况 本研究得到了土耳其科学和技术研究委员会（TüBITAK，项目编号121N276）、欧洲罕见疾病联合计划（EJPRD）的资助，同时还获得了欧盟（通过“地平线2020”计划下的ERA主席计划以及RareBoost项目，项目编号952346）的部分支持。A.C.K.和G.K.还获得了土耳其高等教育委员会颁发的100/2000博士奖学金以及TüB?TAK-B?DEB的2211A类奖学金；G.K.还获得了TüB?TAK的2214A类奖学金；B.K.则是TüB?TAK的2211C类奖学金获得者。A.C.K.、G.K.和B.K.还共同获得了TüB?TAK的2250类奖学金。
利益冲突声明 A.M.是SZA Longevity、Trustlife Therapeutics、ScandiBio Therapeutics以及ScandiEdge Therapeutics公司的联合创始人兼股东；G.K.是Solaris Genomics公司的联合创始人兼股东。其余作者均不存在利益冲突。
致谢 本研究得到了土耳其科学和技术研究委员会（TüBITAK，项目编号121N276）、欧洲罕见疾病联合计划（EJPRD）的资助，同时还获得了欧盟（通过“地平线2020”计划下的ERA主席计划以及RareBoost项目，项目编号952346）的部分支持。A.C.K.和G.K.还获得了土耳其高等教育委员会颁发的100/2000博士奖学金以及TüB?TAK-B?DEB的2211A类奖学金；G.K.还获得了TüB?TAK的2214A类奖学金；B.K.则是TüB?TAK的2211C类奖学金获得者。A.C.K.、G.K.和B.K.还共同获得了TüB?TAK的2250类奖学金。此外，作者们还要向IBG表示感谢。
Ali Can Koc|Gamze Kocak|Burak Kahveci|Adil Mardinoglu|G?khan Karakülah|Canan Asl? Utine|Sinan Güven
