《Letters in Drug Design & Discovery》：Integrating bioinformatics and machine learning to analyze molecular biomarkers, immune infiltration mechanisms, and small-molecule therapeutic candidates for gallstones
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背景：胆结石作为一种高发消化系统疾病，常诱发慢性炎症，但传统方法难以充分揭示其分子机制。本研究整合生物信息学与机器学习，分析胆结石诱导慢性炎症中的分子标志物、免疫浸润及小分子药物候选物。方法：研究人员从基因表达综合数据库（GEO）下载胆结石诱导慢性炎症患者与健
背景：胆结石作为一种高发消化系统疾病，常诱发慢性炎症，但传统方法难以充分揭示其分子机制。本研究整合生物信息学与机器学习，分析胆结石诱导慢性炎症中的分子标志物、免疫浸润及小分子药物候选物。方法：研究人员从基因表达综合数据库（GEO）下载胆结石诱导慢性炎症患者与健康对照的GSE202479转录组数据，采用基于负二项分布广义线性模型的差异表达筛选方法（DESeq2）筛选差异表达基因（DEGs）。从GeneCards网站获取胆结石相关基因，通过韦恩（Venn）分析确定重叠基因。枢纽基因通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）、基因本体论（GO）及基因集变异分析（GSVA）进行功能富集，并利用字符串（STRING）数据库构建蛋白质?蛋白质相互作用（PPI）网络。随后通过最大团中心性（MNC）、最大连通分量中心性（MCC）、连接度（Degree）、支持向量机?递归特征消除（SVM?RFE）及随机森林（RF）算法进一步筛选枢纽基因。采用Spearman相关性分析免疫细胞浸润及枢纽基因与免疫细胞的相关性，通过基因集富集分析（GSEA）分析关键基因涉及的通路，并利用关联图谱（CMap）网站识别具有治疗作用候选药物。结果：胆结石组与正常组间发现1724个DEGs，其中931个上调、793个下调，主要富集于类固醇激素生物合成、趋化因子信号通路及免疫系统过程。上述DEGs与胆结石相关基因存在174个重叠基因，关联炎症反应与类固醇代谢。PPI网络、SVM?RFE与RF算法进一步筛选出6个枢纽基因（CCR2、CD4、CTSS、CXCL9、FN1及PTPRC）。CD4与CCR2与胆结石患者B谱系、单核谱系及髓样树突状细胞浸润呈正相关。GSEA表明CD4与CCR2参与氨基糖与核苷酸糖代谢及霍乱弧菌（Vibrio cholerae）感染。最终选出评分最高的10个小分子化合物。结论：研究人员确定了6个诊断用生物标志物，明确靶向免疫细胞浸润（B谱系、单核谱系及髓样树突状细胞）有利于改善胆结石诱导的慢性炎症，并预测了10个具治疗潜力的候选药物。
研究背景方面，胆结石是全球高发且复杂的医学疾病，其发病率逐年上升，长期存在常诱发慢性胆囊炎，并可能导致胆囊癌、胆管炎等严重并发症，对人类健康构成显著且不断升级的威胁。目前对胆结石诱发慢性炎症的分子机制尚缺乏深入理解，传统生物信息学方法难以全面分析复杂生物系统，而免疫细胞浸润是炎症发生发展的关键因素，线粒体在免疫细胞激活、慢性炎症及胆汁酸/胆固醇代谢紊乱中起核心作用，但其具体调控机制及与筛选出的枢纽基因的交互尚不清楚。此外，有效小分子治疗候选物的识别是重大挑战，传统药物研发周期长、成本高、成功率低。因此，深入理解胆结石诱发慢性炎症的分子机制，对于该病的早期诊断、治疗干预及预后评估具有重要意义，本研究旨在利用生物信息学与机器学习系统分析相关分子标志物网络、免疫细胞浸润模式及关键调控通路，筛选小分子治疗候选物，为胆石病的精准诊断与靶向治疗提供新理论基础与实验依据。本研究发表于《Letters in Drug Design》。
研究人员主要采用的关键技术方法包括：基于GEO数据库的GSE202479数据集（含3例正常胆囊组织与4例胆结石胆囊组织），使用DESeq2筛选差异表达基因（DEGs）；从GeneCards获取胆结石相关基因并以Venn分析取交集；通过DAVID进行KEGG与GO富集分析，利用MSigDB基因集行GSVA分析；借助STRING与Cytoscape之CytoHubba插件（MCC、MNC、Degree算法）构建PPI网络；采用SVM?RFE与RF算法进一步筛选枢纽基因；使用SangerBox工具之MCPCounter法分析免疫细胞浸润并行Spearman相关分析；应用GSEA软件分析关键基因通路；通过CMap数据库预测小分子化合物。
研究结果如下。
筛选胆结石诱导慢性炎症胆囊组织中的差异表达基因：研究人员对GSE202479数据集行中位数标准化后，以DESeq2筛选出1724个DEGs（931上调、793下调），绘制火山图与热图展示，上调前10含CCL18、CLC等，下调前10含LOC107984203、FOXN4等。
差异表达基因的KEGG与GO分析：对1724个DEGs行KEGG富集显示涉及病毒蛋白与细胞因子受体互作、金黄色葡萄球菌感染、类固醇激素生物合成、趋化因子信号通路等；GO分析显示生物过程（BP）富集免疫系统过程与免疫反应，细胞组分（CC）主要为质膜部分、胞外区域、膜整合组分，分子功能（MF）含信号受体结合、细胞外基质结构成分等。
胆结石相关差异表达基因筛选及KEGG与GO数据库分析：将1724个DEGs与GeneCards中1358个胆结石相关基因取交集得174个重叠基因；KEGG分析富集于胆汁分泌、类固醇激素生物合成、细胞因子?细胞因子受体互作等；GO的BP主要含炎症反应与类固醇代谢过程，CC主要为质膜外侧、胞外空间、细胞表面，MF主要涉及信号受体结合。
胆结石诱导慢性炎症胆囊组织差异通路的GSVA分析：GSVA火山图显示6条上调与5条下调通路；上调显著者含I型糖尿病、N?聚糖生物合成、FcγR介导的吞噬作用、RIG?I样受体信号通路、致病性大肠杆菌感染等，下调显著者含近曲小管碳酸氢盐重吸收、磷脂酰肌醇信号系统、其他酶的药物代谢、醛固酮调节钠重吸收、抗坏血酸与醛糖酸代谢。
基于PPI网络与机器学习筛选枢纽基因：将174个基因经STRING构建PPI网络，以CytoHubba之MCC、MNC、Degree算法各取TOP20并集得10个重叠枢纽基因（CD4、FN1、PTPRC、ITGAM、CXCL10、CD163、CCR2、CTSS、CXCL9、CD19）；SVM?RFE显示特征数为6时交叉验证准确率最高（0.889），选出7个重要性为1的基因（CCR2、CD19、CD4、CTSS、CXCL9、FN1、PTPRC）；RF算法选出7个贡献最大基因（PTPRC、CD4、CCR2、CXCL9、CTSS、FN1、CXCL10）；两者交集得6个枢纽基因（CCR2、CD4、CTSS、CXCL9、FN1、PTPRC）。
枢纽基因与免疫细胞的关系：MCPCounter显示胆结石组中性粒细胞、髓样树突状细胞、单核谱系、B谱系浸润显著高于正常组；Spearman相关显示PTPRC与T细胞（r＝0.96）、单核谱系（r＝0.89）正相关，CTSS与单核谱系（r＝0.82）正相关，CD4与B谱系（r＝0.86）、单核谱系（r＝0.96）、髓样树突状细胞（r＝00.86）正相关，CXCL9与B谱系（r＝0.96）、单核谱系（r＝0.89）、髓样树突状细胞（r＝0.86）、成纤维细胞（r＝0.82）正相关，CCR2与B谱系（r＝0.82）、单核谱系（r＝0.89）、髓样树突状细胞（r＝0.89）正相关；分组比较显示胆结石组B谱系、单核谱系、髓样树突状细胞浸润及CD4、CCR2表达显著上调，证实CD4与CCR2与免疫细胞浸润密切相关。
CD4与CCR2的GSEA分析：GSEA显示CD4显著富集于慢性髓系白血病、氨基糖与核苷酸糖代谢、DNA复制、霍乱弧菌感染、错配修复等通路；CCR2显著富集于氨基糖与核苷酸糖代谢、慢性髓系白血病、霍乱弧菌感染、溶酶体等通路。
与核心基因相互作用的小分子化合物预测：基于前期筛选的10个枢纽基因（CD4、FN1、PTPRC、ITGAM、CXCL10、CD163、CCR2、CTSS、CXCL9、CD19）在疾病状态均上调，通过CMap预测得到评分最高的10个小分子化合物，依次为GR?206（芳香烃受体配体）、KIN001–266（MAP激酶抑制剂）、FK?866（烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂）、fraxetin（抗氧化剂）、aminolevulinic?acid（氧化剂）、retinol（维甲酸受体激动剂）、carbachol（胆碱能受体激动剂）、BTS?54505（多巴胺受体拮抗剂｜肾上腺素受体拮抗剂｜去甲肾上腺素再摄取抑制剂｜血清素再摄取抑制剂）、risperidone（多巴胺受体拮抗剂｜血清素受体拮抗剂）、moxidectin（氯离子通道阻断剂），其raw_cs与norm_cs均为负值，提示潜在治疗作用。
讨论部分总结：研究人员指出胆结石长期存在可诱发慢性胆囊炎并与胆囊癌风险增加相关，本研究整合生物信息与机器学习筛选DEGs与分析免疫细胞浸润，为胆石病诊疗提供新理论基础。既往研究已证实生物信息学在阐明胆结石分子机制中的效用，本研究DEGs富集于类固醇激素生物合成与免疫系统过程调节，174个重叠基因富集于胆汁分泌、类固醇激素生物合成、胆固醇代谢、炎症反应、免疫系统调节及趋化因子信号通路，GSVA显示与糖尿病及细菌感染相关。研究识别出6个与免疫浸润及代谢紊乱密切相关的枢纽基因（CCR2、CD4、CTSS、CXCL9、FN1、PTPRC），并探讨线粒体功能与上述基因的潜在调控关系，提出“线粒体代谢?枢纽基因表达?免疫浸润”调控轴的假设，其中CD4与CCR2的表达依赖线粒体能量代谢与活性氧（ROS）平衡，单核谱系细胞线粒体呼吸异常可通过NF?κB/ROS信号通路上调CCR2，FN1参与线粒体膜损伤修复与线粒体自噬调节，CTSS与CXCL9分泌受线粒体钙离子稳态调节，PTPRC调节免疫细胞线粒体ROS产生并激活NF?κB炎症信号通路，CD4与CCR2富集的氨基糖与核苷酸糖代谢与线粒体己糖胺生物合成途径（HBP）相关。研究通过CMap筛选出10个小分子化合物，可双重靶向枢纽基因表达与胆结石核心病理过程，部分具调节胆汁酸/胆固醇代谢、抗炎及靶向线粒体功能潜力，可作为先导化合物开发靶向药物。局限性在于结果基于公共数据库分析，缺乏体外细胞与体内动物实验验证因果，GSE202479样本量小（3正常、4胆结石）且无临床分层与多中心大样本验证，缺乏具体分子互作机制与多组学数据支持，小分子化合物仅经基因表达匹配预测而缺临床前与临床试验证据。
研究结论部分翻译：我们的研究确定了6个用于诊断的生物标志物。确定靶向免疫细胞浸润（B谱系、单核谱系及髓样树突状细胞）有利于改善胆结石诱导的慢性炎症。此外，预测了10个具有治疗潜力的候选药物。研究人员确定了6个胆结石诱导慢性炎症的诊断用生物标志物，确认靶向B谱系、单核谱系及髓样树突状细胞浸润联合线粒体功能调节有助于改善炎症，并预测了10个具治疗潜力的候选药物。本研究丰富了胆结石疾病的分子机制，为生物信息学与机器学习整合应用于消化疾病研究提供了新范式，有望推动胆道疾病精准诊断与靶向治疗的发展。然而，结果仅基于生物信息学分析，无实验验证或大样本临床证据，限制了直接临床转化；后续需补充体外/体内实验、多中心临床数据与多组学分析以验证可靠性与可行性。
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