靶向PD-L1与VEGF的双特异性抗体Tab1在临床前模型中展现出增强的抗肿瘤疗效

《Letters in Drug Design & Discovery》：A bispecific antibody Tab1 targeting PD-L1 and VEGF demonstrates enhanced antitumor efficacy in preclinical models

　　

背景：单独靶向程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）或血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的单药治疗常因肿瘤耐药导致疗效欠佳。本研究开发了Tab1这一新型双特异性抗体，旨在同时阻断PD-L1与VEGF以增强抗肿瘤疗效。方法：研究人员通过将抗VEGF单域抗体融合至人源化抗PD-L1 IgG1的C端构建Tab1，在体外评估其结合亲和力、对PD-1/PD-L1及VEGF/VEGFR2通路的功能性阻断、T细胞活化及抗增殖效应；利用多种人源化小鼠模型评估体内抗肿瘤疗效与药代动力学。结果：Tab1对两个靶点均保持与基准抗体atezolizumab、bevacizumab相当的高亲和力结合，可有效阻断相应信号通路并增强T细胞活化；在四种体内模型中，11.6?mg/kg的Tab1诱导强劲的肿瘤生长抑制（74–77%），优于对应单特异性抗体且与亲本抗体联合用药相当，其末端半衰期（terminal half-life）为2.2天。结论：Tab1在临床前模型中展现出强效的双靶向活性与更优的抗肿瘤疗效，支持其作为难治性肿瘤的单一疗法进一步开发。

《Letters in Drug Design 》发表的该研究围绕克服现有PD-L1或VEGF单药免疫治疗耐药问题展开。癌症治疗中化疗与放疗缺乏特异性易致全身毒性，免疫检查点抑制剂虽具临床优势但响应率不稳定且获得性耐药常见；PD-L1通过结合T细胞上程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD?1）抑制T细胞活化促免疫逃逸，VEGF除驱动肿瘤血管生成外还通过抑制树突状细胞成熟、扩增调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）及招募髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）促免疫抑制微环境，且VEGF可通过VEGFR2-STAT3信号轴上调PD-L1表达，因此同时阻断PD-L1与VEGF的双靶向策略具备合理性，双特异性抗体可在单分子中同时结合两靶点以克服单药局限。研究人员开发新型PD-L1×VEGF双特异性抗体Tab1，在体外与多个人源化小鼠模型中验证其结合活性、功能阻断、T细胞活化、抗肿瘤疗效及药代动力学，结果显示Tab1保留双靶点高亲和力与功能活性，体内抗肿瘤疗效优于单特异性抗体且与亲本联合用药相当，末端半衰期2.2天，证明其作为难治性肿瘤单药治疗的开发潜力。

研究人员主要采用杂交瘤、噬菌体展示与酵母展示平台制备亲本抗PD-L1单抗与抗VEGF单域抗体并人源化及亲和力成熟，通过重组DNA技术以柔性七肽链接（DIEGRMD）将抗VEGF单域抗体VE21融合至抗PD-L1单抗L3H3重链Fc段C端构建IgG-VHH格式双特异性抗体Tab1；使用酶联免疫吸附测定（ELISA）、表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）、流式细胞术评估结合与阻断活性；通过混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction，MLR）与CCK?8评估T细胞活化与内皮增殖抑制；利用NOG-DKO、NCG、BALB/c-hPD1/hPDL1转基因小鼠等人源化肿瘤移植模型（移植A375、A431、CT26-hPDL1、Huh?7细胞并辅以人外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）植入）评估体内疗效；在hFcRn转基因小鼠中通过ELISA与非房室模型分析药代动力学。

3.1. Generation and production of a novel PD-L1?×?VEGF bsAb

研究人员通过IgG-VHH格式将VE21融合至L3H3重链Fc段C端构建Tab1；经小鼠免疫PD-L1抗原通过杂交瘤与人源化获L3H3，羊驼免疫后构建噬菌体与酵母展示库筛选、人源化及亲和力成熟获VE21，证实成功构建双特异性分子。

3.2. Manufacturability evaluation of Tab1

研究人员通过ExpiCHO-S细胞瞬时表达、尺寸排阻高效液相色谱（size-exclusion high-performance liquid chromatography，SEC-HPLC）、疏水相互作用色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）-HPLC、成像毛细管等电聚焦（imaged capillary isoelectric focusing，iCIEF）与蛋白热偏移评估发现，Tab1瞬产产量300?mg/L，单体纯度96.3%，VHH与Fab熔解温度分别为59.83?℃与80.28?℃，具备良好生物物理属性与可生产性。

3.3. Tab1 Is a potent dual inhibitor of VEGF- and PD-L1-mediated activities in vitro

研究人员通过ELISA、流式细胞术、NFAT驱动荧光素酶报告实验、SPR、CCK?8与MLR评估发现，Tab1结合PD-L1的EC₅₀为1.54?nM、结合VEGF为0.71?nM，阻断PD?1/PD-L1的IC₅₀为0.029?μg/mL，阻断VEGF/VEGFR2与抑制内皮增殖及促进IL?2分泌效力分别与bevacizumab、atezolizumab相当，SPR显示其对PD-L1与VEGF的K_D分别为1.03?×?10^?9?M与9.72?×?10^?12?M，证实Tab1在体外保留双亲本抗体结合与功能阻断活性。

3.4. Antitumor efficacy of Tab1 in mouse tumor models

研究人员在A375人黑色素瘤、A431皮肤鳞癌、CT26-hPD-L1小鼠结肠癌、Huh?7人肝癌四人源化移植模型中评估发现，11.6?mg/kg Tab1的肿瘤生长抑制（TGI_TV）分别为77%、75%、74%、66%，优于对应单特异性抗体L3H3与VE21或atezolizumab与bevacizumab，在CT26模型中与L3H3＋VE21联合（80%）相当，在Huh?7模型中优于Ivonescimab（60%），且各治疗组无显著体重下降或毒性迹象，证实Tab1在多模型中抗肿瘤活性优于单药。

3.5. Pharmacokinetics of Tab1 in hFcRn transgenic mice

研究人员在hFcRn转基因小鼠单次腹腔注射10?mg/kg Tab1后通过ELISA与Phoenix WinNonlin非房室分析发现，Tab1末端半衰期约为2.2?±?0.1天。

讨论部分指出，单克隆抗体单药响应率有限，VEGF与PD?1/PD-L1阻断均存在耐药，需合理联合或多靶向策略；Tab1以IgG-VHH格式统一靶向两互补通路，保留双亲本活性并在体内外展现增强疗效，与已进入早期临床的HB0025、CVL006、IMM2510等同属PD-L1?×?VEGF双特异性竞争赛道且具差异化；研究推断Tab1机制包括阻断PD-L1/PD?1解除免疫抑制、抑制VEGF阻断血管生成、血管调控促免疫微环境改善T细胞浸润，但机制需后续免疫组化等直接验证；Tab1具高单体纯度与热稳定性等可生产性优势，但存在体内剂量窗与高剂量毒性未明、机制未直接验证、药代仅在非荷瘤hFcRn鼠单剂量评估、安全性仅靠体重与临床观察、模型无法完全模拟人肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）等局限，未来需剂量递增、TME免疫与血管分析、多剂量PK/PD、重复给药毒理及非人灵长类评估与生物标志物设计以夯实临床转化依据。结论部分翻译为：Tab1在临床前模型中展现出强效的双靶向活性与更优的抗肿瘤疗效，支持其作为难治性肿瘤的单一疗法进一步开发。