靶向NAT1-ENO1-乳酸轴破坏PD-L1稳定性以重塑结直肠癌抗肿瘤免疫

《MedComm》：Targeting the NAT1-ENO1-Lactate Axis Destabilizes PD-L1 to Reinvigorate Antitumor Immunity in Colorectal Cancer

　　

代谢失调是肿瘤发生的标志并对免疫监视产生深远影响；然而，在结直肠癌（CRC）中其潜在机制与靶向治疗仍有限。研究人员利用公共数据库、小鼠模型与多组学分析，鉴定出N-乙酰转移酶1（NAT1）作为关键的预后相关基因，并成为CRC中肿瘤免疫的重要调节因子。研究人员证实NAT1抑制糖酵解与乳酸生成，从而促进免疫激活的肿瘤微环境（TME）。在机制上，NAT1与关键糖酵解酶烯醇化酶1（ENO1）相互作用，在赖氨酸343（K343）位点使其乙酰化，从而抑制其活性。然而，肿瘤细胞中NAT1缺失导致ENO1活化增强，进而驱动糖酵解与乳酸生成。乳酸随后结合TNF受体相关因子6（TRAF6），促进其寡聚化与活化，导致PD-L1的K63连接泛素化，增强PD-L1稳定性并促进免疫逃逸。重要的是，NAT1低表达的CRC患者肿瘤对抗PD-1治疗敏感性增加，且在临床前小鼠模型中NAT1缺陷显著改善抗PD-L1抗体治疗效果。综上，研究结果强调了NAT1在重塑TME中的关键作用，并提示靶向NAT1-ENO1-乳酸轴代表了一种增强CRC免疫治疗的 promising 治疗策略。

研究背景方面，结直肠癌（CRC）发病率与死亡率居高不下，免疫检查点阻断（ICB）在多数CRC患者中疗效有限，其耐药源于肿瘤免疫原性低及免疫抑制性肿瘤微环境（TME）。程序性死亡配体1（PD-L1；CD274）高表达驱动免疫逃逸，但其调控机制在CRC中尚未完全阐明。代谢重编程是肿瘤细胞特征，乳酸分泌增加促进进展并与免疫治疗耐药相关，但细胞内乳酸如何作为信号分子调控PD-L1蛋白稳定性不清。因此，研究人员开展本研究以明确关键调控分子及机制，为CRC免疫治疗提供新靶点。该研究发表于《MedComm》，得出NAT1通过乙酰化ENO1抑制糖酵解与乳酸生成，减少乳酸结合TRAF6介导的PD-L1稳定，从而重塑TME并增强免疫治疗疗效的结论，意义重大在于揭示代谢-免疫检查点轴及NAT1作为预测生物标志物的价值。

作者开展研究用到的主要关键技术方法包括：利用TCGA-COAD数据集进行差异表达与生存分析；采用AOM/DSS诱导与Apc^Min/+驱动的CRC小鼠模型（样本来源为公共数据库及苏州大学附属医院CRC患者原发组织）；运用10×单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析TME免疫细胞浸润；进行乙酰化蛋白质组学与质谱（MS）鉴定乙酰化位点；通过免疫共沉淀（Co-IP）与表面等离子体共振（SPR）验证蛋白互作；利用代谢流分析（ECAR与¹³C₆-葡萄糖示踪）检测糖酵解；构建Nat1^?/?、Eno1^K343Q(Het)与Traf6^+/?基因工程小鼠；开展体内抗PD-L1治疗实验与流式细胞术免疫表型分析。

研究结果如下。

2.1 NAT1 Deficiency Predicts Aggressive Phenotype, Poor Prognosis, and an Immunosuppressive Microenvironment in CRC：研究人员通过分析TCGA-COAD数据与临床样本，发现NAT1在CRC组织中下调且与不良预后相关，其表达与CD8⁺ T细胞浸润呈弱正相关，提示NAT1是预后生物标志物与免疫调节因子。

2.2 NAT1 Deficiency Promotes Colorectal Tumorigenesis in AOM/DSS and Apc-Mutant-Induced CRC Mouse Models：在AOM/DSS与Apc^Min/+小鼠模型中，Nat1^?/?小鼠结肠与肠道肿瘤数目、负荷及Ki-67增殖显著增加，表明NAT1在体内作为CRC抑癌基因。

2.3 NAT1 Loss Reshapes the Immune TME and Impairs CD8⁺ T-Cell Antitumor Function：scRNA-seq与流式显示Nat1缺陷肿瘤中CD8⁺ T、CD4⁺ T与B细胞比例降低，浸润CD8⁺ T细胞TNF-α与颗粒酶B（GzmB）减少且PD-1⁺耗竭亚群增加；Nat1过表达抑制肿瘤生长依赖CD8⁺ T细胞；临床样本上皮NAT1与CD8⁺ T细胞毒性基因GZMK、NKG7正相关。

2.4 NAT1 Interacts With and Acetylates ENO1 at K343 to Inhibit ENO1 Activity and Lactate Production：乙酰化蛋白质组鉴定NAT1介导ENO1 K343乙酰化；Co-IP与体外乙酰化证实该位点特异性；NAT1过表达抑制ENO1酶活性、葡萄糖摄取与乳酸排泄，而K343R突变丧失此抑制，表明NAT1通过乙酰化ENO1抑制糖酵解。

2.5 ENO1 Acetylation at K343 Decreases Lactate Production and Enhances CD8⁺ T-Cell-Mediated Antitumor Activity：Eno1/K343Q（模拟乙酰化）MC38细胞与Eno1^K343Q(Het)小鼠肿瘤中ENO1活性与乳酸降低，CD8⁺ T细胞浸润与效应增强、耗竭减少，肿瘤生长减慢且生存期延长，证明ENO1 K343乙酰化抑制乳酸并促进免疫活性TME。

2.6 NAT1 Deficiency Drives Tumor Immune Evasion by Promoting PD-L1 Expression：转录组与蛋白检测显示NAT1不影响CD274 mRNA但下调PD-L1蛋白；Nat1^?/?小鼠与NAT1沉默细胞PD-L1上调；Eno1/WT而非K343Q恢复PD-L1；Nat1缺陷MC38-OVA削弱CD8⁺ T杀伤，Cd274缺失逆转Nat1缺陷的促瘤与免疫抑制，表明NAT1通过ENO1-乳酸轴负调PD-L1。

2.7 NAT1 Regulates PD-L1 Expression in a Manner That Is Dependent on Lactate：外源乳酸上调PD-L1；LDH抑制剂GSK2837808A抑制乳酸生成降低PD-L1且乳酸回补恢复；GSK2837808A抑制NAT1沉默诱导的PD-L1上调，证实NAT1经乳酸调控PD-L1。

2.8 Lactate Promotes PD-L1 Protein Stability Through Binding and Activating TRAF6：生物素-乳酸pull-down与质谱鉴定TRAF6为乳酸互作蛋白；SPR与分子动力学模拟证实乳酸直接结合TRAF6（残基E59、K133、E156）；乳酸促进TRAF6寡聚化与K63自泛素化；TRAF6介导PD-L1 K63连接泛素化增强其稳定性与膜定位，TRAF6沉默或突变体阻断乳酸效应。

2.9 Reduced Traf6 Expression Inhibits Nat1 Deficiency-Induced PD-L1 Expression and Enhances T-Cell Antitumor Immunity in a Mouse Model：Nat1^?/?;Traf6^+/?小鼠较Nat1^?/?;Traf6^+/+肿瘤减少、PD-L1下调，CD8⁺ T细胞效应恢复且耗竭减少，证明TRAF6是NAT1缺陷介导免疫抑制的关键驱动。

2.10 NAT1-Deficient Tumors Display Heightened Sensitivity to Anti-PD-L1 Therapy in Preclinical Models：MC38与AOM/DSS模型中，Nat1缺陷肿瘤对抗PD-L1治疗响应更佳，治疗组CD8⁺ T浸润、TNF-α⁺GzmB⁺比例增加且PD-1⁺耗竭减少；临床抗PD-1治疗CRC患者中低NAT1表达者响应更好，提示NAT1为疗效预测标志物。

讨论部分总结：研究人员指出肿瘤浸润淋巴细胞尤其是CD8⁺ T细胞与预后相关但常不足清除肿瘤；NAT1作为II相代谢酶此前免疫机制不明，本研究揭示其作为乙酰转移酶乙酰化ENO1 K343抑制活性，缺失致ENO1活化、乳酸增加，乳酸结合TRAF6促其寡聚化与K63自泛素化激活，进而催化PD-L1 K63泛素化增强稳定性与膜定位、抑制T细胞；既往乳酸多经转录调控PD-L1，本研究首次揭示乳酸作为信号分子结合TRAF6调控PD-L1稳定性；NAT1缺陷虽减少CD8⁺ T但增加耗竭亚群，反而提升抗PD-L1疗效；低NAT1可作CRC免疫疗效预测标志物。局限包括NAT1在CRC下调机制未明及可能影响其他免疫细胞。

研究结论部分翻译：研究人员研究确定NAT1是CRC免疫动态的关键调节因子，调控影响肿瘤进展与治疗响应的代谢-免疫检查点轴。代谢与免疫景观的相互作用为治疗干预开辟新途径，特别是靶向CRC内免疫逃逸机制。通过关注NAT1缺陷产生的脆弱性，可增强现有治疗效果并制定针对CRC患者特定需求的稳健治疗策略。