基因工程益生菌纳米平台用于超声增强的结直肠癌治疗：靶向递送、免疫调节和抗血管生成

《MedComm》：Genetically Engineered Probiotic Nanoplatform for Ultrasound-Enhanced Colorectal Cancer Therapy via Targeted Delivery, Immune Modulation, and Anti-Angiogenesis

　　

结直肠癌（CRC）仍然是全球癌症相关死亡的主要原因，很大程度上归因于早期诊断和有效治疗的局限性。为了解决这些挑战，研究人员开发了一种多功能益生菌纳米平台EcNA@Cur-Lip-FA，该平台整合了实时诊断、靶向治疗和免疫调节，以增强CRC治疗。具体而言，该系统利用基因工程的大肠杆菌Nissle 1917（EcN），其编码声学报告基因（ARGs）以产生超声（US）响应性气体囊泡（GVs），从而实现实时、无创的肿瘤成像。同时，叶酸（FA）修饰的姜黄素负载脂质体（Cur-Lip-FA）与EcN共同递送，增强了肿瘤特异性积累和治疗精准度。在被肿瘤细胞摄取后，姜黄素在US照射下局部释放，产生活性氧（ROS），诱导免疫原性细胞死亡（ICD），并激活cGAS-STING通路，以促进树突状细胞（DCs）成熟和强大的CD4⁺/CD8⁺ T细胞反应。此外，EcNA@Cur-Lip-FA下调血管生成相关因子（VEGF、VEGFR1和ANGPT1），从而抑制肿瘤新生血管生成。体外和体内研究表明，EcNA@Cur-Lip-FA能够实现精准的肿瘤定位、动态成像，并有效抑制原发性CRC和转移性肝脏病变，且具有良好的生物相容性。该多功能平台为整合诊断与治疗提供了一种有前景的策略，为下一代CRC诊疗一体化铺平了道路。

**论文解读：基因工程益生菌纳米平台用于超声增强的结直肠癌诊疗一体化研究**

**研究背景与意义**

结直肠癌（CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，早期诊断和治疗对于改善患者预后至关重要。然而，当前主要依赖结肠镜等诊断手段，存在不便、成本高且可能引发并发症等局限。超声（US）成像虽具有无创、实时、可重复等优势，但在CRC诊断中常受肠道气体干扰，难以准确评估肿瘤形态和浸润深度。同时，传统治疗手段如光动力疗法、化疗等在诱导活性氧（ROS）时面临系统毒性、治疗位点受限和疗效欠佳等问题。天然多酚姜黄素虽具有强ROS生成能力、可诱导免疫原性细胞死亡（ICD）并激活cGAS-STING通路，但因其溶解度、稳定性和生物利用度差而限制临床应用。为解决上述问题，研究人员开发了一种整合诊断与治疗的多功能益生菌纳米平台EcNA@Cur-Lip-FA，通过基因工程改造大肠杆菌Nissle 1917（EcN）使其表达声学报告基因（ARGs），产生超声响应性气体囊泡（GVs），实现实时无创成像；同时装载叶酸（FA）修饰的姜黄素脂质体（Cur-Lip-FA），实现肿瘤特异性靶向和药物递送。该平台在超声照射下释放姜黄素，引发ROS介导的DNA损伤、ICD及cGAS-STING通路激活，进而促进树突状细胞（DCs）成熟和T细胞免疫应答，并通过下调血管生成因子抑制肿瘤新生血管。该研究发表在《MedComm》。

**主要技术方法概述**

研究人员构建了基因工程菌株EcNA：将pET28a-bARG1质粒转化至EcN，经IPTG诱导表达GVs，并通过离心浮选纯化。采用经典薄膜法制备FA修饰的姜黄素脂质体（Cur-Lip-FA），随后通过聚（烯丙胺盐酸盐）（PAH）静电吸附将EcNA与Cur-Lip-FA结合形成纳米颗粒。动物实验使用了BALB/c小鼠（来源：SPF Biotechnology），建立原位结肠癌模型（经盲肠壁注射CT26-Luc细胞）和肝转移模型（经脾注射CT26-Luc细胞）。主要技术包括：透射电镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）表征形态、动态光散射（DLS）测量粒径和电位、紫外-可见光谱验证药物负载、Western blot（WB）检测蛋白表达、流式细胞术（FCM）分析免疫细胞、免疫荧光染色、彗星实验和γ-H2AX染色评估DNA损伤、ELISA检测细胞因子、小动物活体成像监测肿瘤生长等。

**研究结果**

**2.1 制备与表征：** 通过TEM、AFM、DLS等证实EcNA@Cur-Lip-FA成功构建，菌体表面吸附脂质体，内部可见GVs，粒径约3085.7 nm，电位-25.2 mV。在pH 5.0和US照射下，姜黄素48小时累积释放率约80%，实现pH和US响应性控制释放。口服药代动力学显示EcNA@Cur-Lip-FA显著提高血浆姜黄素浓度。US成像表明EcNA@Cur-Lip-FA能清晰显示肿瘤边界，增强肿瘤检测能力。

**2.2 细胞摄取、细胞毒性与抗肿瘤效果：** 在CT26细胞中，Cy5.5标记的纳米平台在8小时内被有效摄取。CCK-8实验显示剂量依赖性细胞毒性，IC50用于后续实验。Calcein-AM/PI染色和FCM显示EcNA@Cur-Lip-FA+US组凋亡率达35.6%，显著高于其他组（p<0.001）。TUNEL染色阳性率17.7%，WB证实凋亡相关蛋白（Caspase-3、Bax）上调，Bcl-2下调。克隆形成实验和EdU实验表明该组增殖抑制最强，克隆形成率低于20%。

**2.3 ROS介导的DNA损伤与免疫原性细胞死亡：** DCFH-DA探针检测显示EcNA@Cur-Lip-FA+US组ROS水平最高（为Cur-Lip-FA+US组的1.6倍，EcNA@Cur-Lip-FA组的2.7倍）。ROS导致线粒体膜电位下降，彗星实验和γ-H2AX免疫荧光证实DNA双链断裂（DSB）。cGAS-STING通路蛋白（p-STING、p-TBK1、p-IRF3）表达上调，IFN-β分泌增加。同时，CRT暴露增加，HMGB1释放和ATP分泌升高，表明ICD发生。将处理后的CT26细胞上清与骨髓来源DCs共培养，FCM显示EcNA@Cur-Lip-FA+US组DCs成熟率（CD80⁺CD86⁺）显著高于其他组。

**2.4 抗血管生成效应：** 划痕实验显示EcNA@Cur-Lip-FA+US组HUVECs迁移率仅4.16%，Transwell侵袭实验证实侵袭能力显著降低。免疫荧光和WB显示VEGF、VEGFR1、ANGPT1表达下调。管形成实验显示总分支长度减少60.2%，结点数减少72.2%；主动脉环实验显示微血管芽减少80.9%。肿瘤缺氧标志物HIF-1α和乳酸积累减少。

**2.5 生物安全性评估：** 溶血实验表明溶血率低于5%，H&E染色显示主要脏器无病理异常，血常规和生化指标无显著变化，安全性良好。

**2.6 原位结直肠癌模型治疗：** 活体生物发光成像显示EcNA@Cur-Lip-FA+US组肿瘤信号几乎完全抑制，生存期显著延长。H&E染色显示肿瘤细胞凋亡坏死，免疫荧光显示TUNEL阳性增加，Ki67、CD31、HIF-1α、VEGF荧光强度降低。

**2.7 肿瘤免疫微环境调控：** 转录组学分析鉴定出983个上调基因和583个下调基因，KEGG富集显示细胞因子-受体相互作用、PI3K-Akt信号等通路激活，GO分析显示免疫系统激活等生物学过程上调。FCM显示肿瘤引流淋巴结和肿瘤组织中成熟DCs比例增加，肿瘤内CD8⁺T细胞增加约4.5倍，GZMB⁺和IFN-γ⁺ CD8⁺T细胞比例升高，脾脏中CD4⁺和CD8⁺T细胞增加，而调节性T细胞（Tregs）比例在肿瘤和脾脏中均降低。血清中IL-6、TNF-α、IL-12p70水平升高。

**2.8 肝转移抑制：** 肝转移模型中，EcNA@Cur-Lip-FA+US组肝脏形态良好，转移结节极少或缺失，肝脏器官系数降低，H&E染色仅见散在微小病灶。血清IL-6、TNF-α、IL-12p70水平显著升高，生存期明显延长。

**总结与讨论**

本研究成功构建了整合诊断与治疗的益生菌纳米平台EcNA@Cur-Lip-FA。该平台通过基因工程EcN表达ARGs实现US实时成像，同时通过FA修饰的姜黄素脂质体实现肿瘤靶向递送。在US照射下，姜黄素释放并产生ROS，一方面诱导DNA损伤激活cGAS-STING通路，另一方面触发ICD，两者协同促进DCs成熟和T细胞免疫应答。此外，该平台还可下调VEGF、VEGFR1、ANGPT1等血管生成因子，抑制肿瘤新生血管，改善缺氧微环境。体内实验证实该平台能有效抑制原位CRC肿瘤生长和肝转移，并重塑免疫微环境（增加CD8⁺T细胞、减少Tregs）。研究结论表明，EcNA@Cur-Lip-FA结合US照射通过实时无创诊断、靶向药物递送、免疫激活和抗血管生成的多重机制，实现了CRC的协同诊疗一体化，为下一代CRC诊疗策略提供了新范式。