输注体外扩增的同种异体犬自然杀伤细胞治疗转移性实体瘤的安全性和可行性

《Veterinary and Comparative Oncology》：Safety and Feasibility of Infusing Ex Vivo Expanded Allogeneic Canine Natural Killer Cells for the Treatment of Metastatic Solid Tumours

　　

伴侣犬在实体瘤恶性肿瘤的治疗选择上需要进展。自然杀伤（NK）细胞输注为患有实体瘤的犬提供了一种有前景的治疗方式。自体NK细胞产品受限于免疫功能障碍以及制造过程延迟治疗，而同种异体NK细胞则提供了从健康供体施用的“现成”治疗的可能性。研究人员通过密度梯度分离从健康犬供体分离外周血单核细胞（PBMCs）。NK细胞使用重组人IL-2（rhIL-2）和犬IL-21进行扩增，并添加转染了CD137配体和膜结合人IL-15的K562饲养细胞。额外实验包括在扩增过程中添加IL-12。通过D17-mKate2犬骨肉瘤细胞系共培养评估体外效力。3只犬在淋巴清除后入组一期临床试验，输注体外扩增的同种异体NK细胞。流式细胞术分析证实了犬NK细胞成功扩增，14天后高达50%的细胞表现为NKp46⁺。残留T细胞数量因供体而异。添加IL-12导致NK细胞扩增增加。Incucyte显示，在更高的效应细胞与靶细胞比例下，骨肉瘤细胞死亡增加，证明了效力。3只患有转移性/难治性实体瘤的犬成功接受了淋巴清除并输注了同种异体NK细胞产品。这些犬对输注耐受良好。犬同种异体NK细胞成功在体外扩增和激活，在体外表现出效力，在体内表现出安全性。进一步的研究将优化NK细胞产品并增加剂量以达到最大耐受剂量。

**论文解读：输注体外扩增的同种异体犬自然杀伤细胞治疗转移性实体瘤的安全性和可行性**

**研究背景与问题**

伴侣犬（如宠物犬）自发发生的恶性肿瘤（如黑色素瘤、淋巴瘤和骨肉瘤）与人类高度相似，其中犬骨肉瘤的发病率约为人类的27倍，且具有相似的遗传和表型特征。与实验室小鼠模型相比，伴侣犬提供了保留宿主免疫系统和肿瘤微环境的独特异质性群体。然而，犬转移性实体瘤的治疗进展缓慢，尤其是骨肉瘤，过去50年治疗模式未发生显著变化，转移性骨肉瘤的5年总生存率仅约30%，复发患者预后更差。因此，亟需开发低毒性的新型疗法以改善儿童和伴侣犬的生存结果与生活质量。

自然杀伤（NK）细胞作为先天免疫系统的一部分，无需预先致敏即可识别并杀伤受损、病毒感染或恶性转化的细胞，且能以不依赖主要组织相容性复合体（MHC）的肿瘤非特异性方式发挥功能。与自体T细胞疗法（如嵌合抗原受体T细胞，CAR T）相比，同种异体NK细胞无需自体制造，可提供“现成”的细胞产品，避免了自体产品因免疫功能障碍和制造延迟导致的治疗局限。此外，同种异体NK细胞不会引起移植物抗宿主病（GVHD）风险，是更具前景的替代方案。然而，此前仅有少数研究探索犬NK细胞疗法，且自体NK细胞输注显示有限的治疗获益。因此，研究人员开展本项研究，旨在评估体外扩增的同种异体犬NK细胞治疗转移性实体瘤的安全性和可行性。

**研究开展与结论**

研究人员从健康犬供体外周血中分离外周血单核细胞（PBMCs），通过添加饲养细胞（K562-41BBL-mbIL15）和细胞因子（重组人IL-2和犬IL-21）进行体外扩增，并探讨了T细胞去除和添加IL-12对NK细胞产物的优化效果。通过体外细胞毒性实验（Incucyte活细胞成像系统）验证NK细胞对骨肉瘤细胞系（D17-mKate2）的杀伤效力。随后，在3只患有转移性/难治性实体瘤的犬中开展I期临床试验，淋巴清除后输注新鲜扩增的同种异体NK细胞，评估安全性和可行性。结果显示，成功实现了犬NK细胞的体外扩增，添加IL-12可增加NK细胞扩增并富集NKp46⁺CD8a⁺双阳性亚群；体外实验显示NK细胞对骨肉瘤细胞具有杀伤活性；3只犬均耐受输注，未发生GVHD，仅出现一过性发热和中性粒细胞减少（可能与化疗相关）。该研究证明了同种异体NK细胞输注的可行性和安全性，为后续剂量递增和疗效评估奠定了基础。论文发表在《Veterinary and Comparative Oncology》。

**主要关键技术方法**

1. **细胞来源与分离**：从威斯康星大学兽医学院血库招募的6只健康犬采集外周血，通过Ficoll密度梯度离心分离PBMCs。
2. **NK细胞扩增**：使用经照射的K562-41BBL-mbIL15饲养细胞（表达4-1BBL和膜结合人IL-15），联合重组人IL-2（rhIL-2）和犬IL-21培养14天；部分实验添加犬IL-12。
3. **T细胞去除**：通过磁珠分选（FITC标记抗CD3抗体及阳性分选试剂盒）在Day 0或Day 14去除CD3⁺ T细胞。
4. **细胞鉴定与功能评估**：流式细胞术检测NKp46、CD3、CD4、CD8等标记物；Incucyte活细胞成像系统分析NK细胞与D17-mKate2骨肉瘤细胞共培养的杀伤动力学。
5. **临床试验方案**：3只犬接受环磷酰胺（400 mg/m²，口服）和氟达拉滨（10 mg/m²，静脉注射）淋巴清除，随后输注新鲜同种异体NK细胞（1.5–5×10⁵ NK细胞/kg），并辅以皮下注射rhIL-2（250,000 IU/kg，第0、7、14天）。

**研究结果**

**3.1 犬PBMC来源的体外扩增NK细胞**
通过流式细胞术确认，从健康犬PBMCs起始培养14天后，NKp46⁺细胞比例从约10.9%增加至60.3%，显示出成功扩增。但不同供体间PBMC初始计数差异较大（34.0–168.6×10⁶），导致NK细胞产量存在显著变异性。

**3.2 T细胞（CD3）去除**
比较Day 0、Day 14或未进行CD3去除对NK细胞产物的影响。流式细胞术显示，Day 0去除CD3⁺ T细胞可显著增加NKp46⁺单阳性细胞比例，并富集更具细胞毒性的NK细胞亚群。

**3.3 添加犬IL-12**
在标准扩增方案（rhIL-2 + 犬IL-21）基础上添加犬IL-12，结果一致地提高了NK细胞扩增倍数（图2A），并特异性扩增出CD8⁺NKp46⁺双阳性细胞群（图3B），该亚群与犬NK细胞杀伤活性相关。

**3.4 体外扩增NK细胞的功能评估**
通过Incucyte活细胞成像系统，将PBMC扩增的同种异体NK细胞与D17-mKate2骨肉瘤细胞共培养（效应靶比1:1、2:1、5:1），结果显示随着效应靶比增加，骨肉瘤细胞死亡显著增加，证实NK细胞的体外杀伤效力。但未添加IL-12的扩增产物中，T细胞比例较高，可能也贡献了部分细胞毒性。

**3.5 I期先导临床试验**
3只患有转移性/难治性实体瘤的犬（1例毛细血管扩张性骨肉瘤、1例原发性肺腺癌、1例乳腺骨肉瘤）成功接受了淋巴清除，并输注了4次体外扩增的同种异体NK细胞（剂量1.7–5.0×10⁵ NK细胞/kg）。所有输注均耐受良好，未观察到GVHD。1例犬在第7天出现短暂4级发热和中性粒细胞减少（可能由化疗引起），经抗生素治疗恢复；1例犬因广泛脑转移在第1周后出现癫痫并安乐死；1例犬因进展性胸腔积液在第7天退出研究。外周血白细胞计数显示淋巴清除成功。

**讨论与结论**

**讨论总结**：研究人员指出，犬NK细胞研究面临的主要挑战是缺乏统一的细胞表面标记物定义。本研究采用NKp46⁺CD3^+/-CD8^+/-CD4^-定义犬NK细胞，CD3⁺CD8^+/-CD4^+/-定义T细胞，以规避GVHD风险。供体间变异性（如不同品种、年龄）导致扩增产物NK/T细胞比例不一致，Day 0 T细胞去除可稳定降低T细胞含量，提高NK细胞产量。添加IL-12可进一步促进NK细胞扩增，并富集NKp46⁺CD8a⁺双阳性群体，该群体在犬中与增强的细胞毒性相关，但其具体类型（NK细胞亚群或NKT细胞）需进一步研究。临床试验中，淋巴清除方案（环磷酰胺+氟达拉滨）安全有效，所有犬耐受良好，但剂量远低于目标（5×10⁶ NK细胞/kg），未来需优化扩增方案（结合IL-12和T细胞去除）以实现剂量递增。此外，由于样本量小且入组犬均为广泛转移性疾病，无法评估疗效，但初步结果支持安全性和可行性。

**研究结论翻译**：研究人员展示了在患有转移性实体瘤的伴侣犬中输注新鲜体外扩增的同种异体NK细胞的可行性和安全性。尽管不同健康供体在相似扩增方案下最终NK细胞和T细胞产量存在很大变异性，但添加IL-12和引入T细胞去除增加了NK细胞数量，并产生了在体外表现出效力的产品。本研究的主要局限性包括患者数量少和NK细胞剂量低（1.5–5×10⁵ NK细胞/kg）。研究人员计划优化NK细胞扩增方法，将NK细胞剂量提升至目标输注剂量5×10⁶细胞/kg，以便在持续安全性和可行性条件下更好地证明疗效。这份中期试验报告为伴侣犬癌症的新型过继细胞疗法的发展做出了贡献。