《MYCOSES》：Reduced Activity of Triazole Antifungal Agents Against Aspergillus tubingensis From a Global Collection of Genomically-Characterized Aspergillus Section Nigri Clinical Isolates (2020–2023)
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背景：由黑曲霉群（Aspergillus section Nigri）组成的黑色霉菌是引起曲霉病和耳真菌病的临床重要病原体；三唑类（azole）抗真菌药物是这些感染的主要预防和治疗选择。黑曲霉群内物种的隐存性质给常规鉴定方法带来了挑战，然而准确的物种鉴定可能揭
背景：由黑曲霉群（Aspergillus section Nigri）组成的黑色霉菌是引起曲霉病和耳真菌病的临床重要病原体；三唑类（azole）抗真菌药物是这些感染的主要预防和治疗选择。黑曲霉群内物种的隐存性质给常规鉴定方法带来了挑战，然而准确的物种鉴定可能揭示物种分布和三唑类抗真菌药物活性中重要且被忽视的趋势。
方法：研究人员采用全基因组测序和比较基因组学对2020年至2023年全球收集的135株临床黑曲霉群分离株进行物种鉴定，并通过肉汤微量稀释药敏试验评估抗真菌药物活性。
结果：韦氏曲霉（A. welwitschiae）（n=61；45.2%）和塔宾曲霉（A. tubingensis）（n=51；37.8%）是主要鉴定出的物种。塔宾曲霉占产生三唑类MIC值高于CLSI确立的黑曲霉流行病学临界值（ECV）分离株的87.9%（n=29/33）。所有三唑类药物对韦氏曲霉和黑曲霉分离株均表现出高活性（≥93.7%野生型[WT]）；泊沙康唑（posaconazole）对塔宾曲霉分离株广泛抑制（100% WT）。对≥2种三唑类药物具有非野生型（NWT）表型的塔宾曲霉分离株的频率以及大多数药物的模态MIC值随时间增加；三唑类NWT分离株在所有地区均有分布。对三唑类活性分子靶点CYP51A和CYP51B的蛋白质序列进行比较，揭示了塔宾曲霉中的独特残基。然而，大多数来自不同物种的三唑类NWT分离株缺乏独特的CYP51A/B改变，表明靶点修饰以外的机制影响该群中三唑类MIC值的升高。
结论：研究人员的结果表明，对临床相关生物群进行物种鉴定有助于更好地理解抗真菌药物活性和物种分布的动态变化。
**论文解读**
**研究背景与问题**
黑曲霉群（Aspergillus section Nigri）是临床重要的病原真菌，主要引起侵袭性曲霉病和耳真菌病。三唑类（azole）抗真菌药物（如伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、艾沙康唑）是预防和治疗这些感染的首选药物。然而，该群内物种形态高度相似，存在隐存种（cryptic species），常规鉴定方法（如MALDI-TOF MS或单基因测序）难以准确区分物种，导致临床常将分离株笼统归为黑曲霉（A. niger）并沿用其流行病学临界值（ECV）评估药敏。这种简化可能掩盖物种间天然的抗真菌药物敏感性差异，且缺乏全球多中心、长时间跨度的物种分布与药敏动态监测研究。因此，研究人员利用全基因组测序（whole genome sequencing, WGS）和比较基因组学对全球收集的临床黑曲霉群分离株进行精确物种鉴定，旨在明确物种分布规律及物种特异性三唑类抗真菌药物活性变化趋势。
**研究内容与结论**
本研究纳入了2020–2023年通过SENTRY抗真菌监测计划（SENTRY Antifungal Surveillance Program）收集的135株非重复临床黑曲霉群分离株，来源包括北美（46株，2国）、欧洲（58株，11国）、亚太地区（30株，5国）和拉丁美洲（1株，1国）。主要结论：1）韦氏曲霉（A. welwitschiae, 45.2%）和塔宾曲霉（A. tubingensis, 37.8%）是优势物种，黑曲霉仅占9.6%；2）塔宾曲霉对三唑类药物普遍敏感性降低，其模态MIC值较韦氏曲霉和黑曲霉高2至>8倍，且对伊曲康唑的非野生型（NWT）比例高达51.0%；3）泊沙康唑对塔宾曲霉仍有100%活性，但其他三唑类药物MIC值随时间呈上升趋势，多重NWT表型分离株比例逐年增加；4）CYP51A/B蛋白序列分析显示塔宾曲霉存在独特残基，但大多数NWT分离株缺乏已知的靶点突变，提示非靶点修饰机制介导其MIC升高。该研究发表于《MYCOSES》。
**关键技术方法**
研究人员采用以下主要方法（忽略试剂与培养步骤）：1）全基因组测序与比较基因组学：对所有分离株进行二代测序（Illumina平台），通过核心SNP系统发育分析、平均核苷酸一致性（ANI）及β-微管蛋白（benA）和钙调蛋白（CaM）基因序列比对进行物种鉴定；2）肉汤微量稀释药敏试验：依据CLSI M38标准测定三唑类药物及两性霉素B的最低抑菌浓度（MIC），并应用黑曲霉ECV判定野生型（WT）与非野生型表型；3）靶点序列分析：提取CYP51A和CYP51B蛋白编码序列，进行种内和种间保守性比较，识别与NWT表型相关的氨基酸变异。样本队列来源于SENTRY抗真菌监测计划2020–2023年全球多中心收集。
**研究结果**
**物种鉴定与系统发育分析**
通过MALDI-TOF MS初步鉴定，81.5%分离株被识别为黑曲霉，但后续全基因组SNP分析、ANI及CaM基因比对一致显示，主要物种为韦氏曲霉（61株，45.2%）和塔宾曲霉（51株，37.8%），黑曲霉仅16株（11.9%）。benA基因鉴定结果与上述方法高度不一致，38株ANI/SNP/CaM鉴定的韦氏曲霉被benA误判为黑曲霉，凸显了非精选数据库（如NCBI）在隐存种鉴定中的潜在错误。
**物种分布的地域-时间趋势**
2020–2023年，塔宾曲霉在总分离株中的比例稳定在37.0%–38.5%，而韦氏曲霉和黑曲霉的年际波动较大。亚太和北美地区以韦氏曲霉为主（分别为46.7%和43.5%），欧洲则以塔宾曲霉为主（53.4%）。黑曲霉在北美比例较高（26.1%），其他地区较低。2022–2023年，亚太和北美地区物种组成趋于多样化，而欧洲相对稳定，由塔宾曲霉或韦氏曲霉交替主导。
**三唑类抗真菌药物活性分析**
针对所有分离株，泊沙康唑活性最高（MIC
50/90 0.5/1 mg/L，100% WT），艾沙康唑和伏立康唑分别有90.4%和91.9%为WT，而伊曲康唑仅77.8%为WT。物种间差异显著：韦氏曲霉和黑曲霉对三唑类药物高度敏感（WT率≥93.7%），仅零星NWT分离株；塔宾曲霉则对伊曲康唑（51.0% NWT）、艾沙康唑（21.6% NWT）和伏立康唑（19.6% NWT）敏感性显著降低，但泊沙康唑仍保持100% WT。自2020年至2023年，塔宾曲霉的伊曲康唑和伏立康唑NWT比例分别从10.0%和0.0%升至80.0%和50.0%，模态MIC值逐年增加，且多重NWT（≥2种三唑）分离株频率同步上升。NWT表型在各地理区域分布均匀，无区域性聚集。
**CYP51A/B序列变异分析**
三组主要物种的CYP51A和CYP51B共识序列高度保守，种内变异率低于2.5%。塔宾曲霉在CYP51A中具有15个与韦氏曲霉/黑曲霉不同的特异残基，CYP51B中第267位为独特苏氨酸（T267）。在33个NWT分离株中，仅2个韦氏曲霉和1个黑曲霉分离株分别携带CYP51A的S270G或T57A突变，1个塔宾曲霉多重NWT分离株携带V17A突变，其余NWT分离株的CYP51A/B序列与WT分离株无差异，且多数变异为系统发育相近菌株间的自然多态性。
**讨论与结论**
本研究证实，在全球临床黑曲霉群分离株中，塔宾曲霉是主要的三唑类NWT物种，其模态MIC值超过黑曲霉ECV，且对伊曲康唑、艾沙康唑和伏立康唑的活性逐年降低，而泊沙康唑仍保持高效。然而，CYP51A/B靶点突变无法解释大多数NWT表型，提示其他机制（如外排泵、生物膜形成或非靶点基因突变）可能参与其中。研究人员强调，继续开展物种水平监测对追踪抗真菌药物活性动态至关重要，而全基因组比较方法可推广至其他隐存种复合体的研究。研究结论：对临床相关生物群进行精确物种鉴定有助于更好地理解抗真菌药物活性和物种分布的动态变化，为优化治疗策略和开发新药提供依据。
