丹酚酸B上调外周血单个核细胞源性细胞外囊泡中miR-744-5p表达以减轻尿毒症心肌病

《Journal of Extracellular Vesicles》：Salvianolic Acid B Upregulates miR-744-5p Expression in Peripheral Blood Mononuclear Cell–Derived Extracellular Vesicles to Alleviate Uremic Cardiomyopathy

　　

尿毒症心肌病（UCM）是尿毒症的一种严重并发症，目前缺乏有效治疗。免疫功能障碍在合并UCM的血液透析患者中的作用仍不清楚。外周血单个核细胞（PBMC）是免疫系统的主要组成部分，但它们不直接接触心肌细胞。通常，细胞外囊泡（EVs）作为细胞间通讯介质发挥作用。因此，在这项研究中，研究人员首先探讨了PBMC来源的EVs（PBMC-EVs）在UCM中的作用，并确定EV-miR-744-5p是参与PBMC-心肌细胞通讯的关键分子。机制上，硫酸吲哚酚（IS）下调PBMC-EVs中miR-744-5p的表达，导致心肌细胞中胰岛素样生长因子2受体（IGF2R）上调，从而通过诱导心肌细胞肥大、凋亡和炎症通路激活加重心肌损伤。研究人员还探索了通过修饰PBMC-EVs使用天然产物治疗UCM的潜力，发现中药单体丹酚酸B（Sal B）可与Yin Yang 1（YY1）结合，增强PBMC-EVs中miR-744-5p的表达，从而减轻UCM中的心肌损伤。综上所述，这些发现表明了PBMC-EVs在UCM中的关键作用，并提示Sal B通过PBMC-EV修饰发挥心脏保护作用。它们还为UCM的免疫机制提供了新的见解，特别指出靶向PBMC-EVs可能是一种有前景的UCM治疗策略。

**研究背景与问题：**
尿毒症心肌病（UCM）是尿毒症患者的严重并发症，其中心血管死亡率较普通人群高10-20倍。硫酸吲哚酚（IS）是主要驱动UCM进展的蛋白结合型尿毒症毒素，但血液中超过90%的IS与蛋白结合，无法直接跨血管壁和细胞外基质作用于心肌细胞。因此，细胞间通讯可能介导IS的间接损伤。免疫功能障碍在尿毒症患者中普遍存在，外周血单个核细胞（PBMC）作为免疫系统核心成分，在UCM相关心肌损伤中起关键作用。然而，循环PBMC无法直接接触心肌细胞，旁分泌机制（如细胞外囊泡（EVs）介导的通讯）可能是主要途径。目前，PBMC-EVs在UCM中通过PBMC-心肌细胞对话促进心肌损伤的机制尚不清楚。此外，直接修饰PBMC-EVs用于临床治疗面临纯化纯度低、安全性阈值未明确、缺乏标准化方案等挑战，因此天然化合物（如丹酚酸B（Sal B））作为替代策略具有潜力。Sal B是丹参中含量丰富、安全且具有生物活性的多酚，具有抗炎、抗氧化和心脏保护作用，且可调节免疫反应。本研究旨在首次评估EV介导的PBMC与心肌细胞相互作用在UCM中的关键作用，并阐明Sal B通过修饰PBMC-EVs发挥抗UCM效应的药理学机制。

**研究内容与结论：**
研究人员通过体内外实验证明：IS刺激的PBMC-EVs（PBMC^IS-EVs）可被心肌细胞内化，诱导心肌细胞肥大、凋亡及NF-κB和p38 MAPK通路激活。小RNA测序（smallRNA-seq）筛选并验证miR-744-5p为PBMC^IS-EVs中下调最显著的miRNA，且其序列高度保守。miR-744-5p主要存在于PBMC-EVs中，并通过EVs递送至心肌细胞。过表达miR-744-5p的PBMC-EVs减轻心肌细胞损伤，而敲低miR-744-5p则加重损伤。在UCM患者中，循环PBMC-EV-miR-744-5p水平较健康对照组显著降低，且与左心室质量指数（LVMI）呈中等负相关。机制上，IGF2R被鉴定为miR-744-5p的直接靶基因，miR-744-5p下调导致IGF2R上调，进而激活NF-κB通路加剧心肌损伤。在5/6肾切除（5/6 Nx）小鼠UCM模型中，注射miR-744-5p过表达的PBMC-EVs可下调心脏IGF2R表达，减轻心肌肥大、改善心功能、抑制NF-κB和p38 MAPK通路激活、减少心肌细胞凋亡。进一步研究发现，Sal B处理可上调PBMC-EVs中miR-744-5p表达，逆转IS诱导的miR-744-5p下调，并部分消除miR-744-5p敲低PBMC-EVs引起的心肌细胞损伤。分子对接、表面等离子体共振（SPR）、细胞热转移分析（CETSA）和药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS）实验证实Sal B直接结合转录因子YY1，降低YY1与miR-744-5p启动子区的结合，从而解除YY1对miR-744-5p的转录抑制，上调miR-744-5p表达。体内实验表明，Sal B的心脏保护作用依赖于上调PBMC-EV-miR-744-5p，当同时注射miR-744-5p敲低PBMC-EVs时，Sal B的疗效显著减弱。该研究发表于《Journal of Extracellular Vesicles》。

**主要技术方法：**
1. **样本队列来源**：收集60例参与者（包括健康对照、尿毒症患者和UCM患者）的PBMC-EVs用于miR-744-5p表达检测；UCM患者依据左心室质量指数（LVMI≥115 g/m2（男性）或≥95 g/m2（女性））从尿毒症队列中筛选。
2. **动物模型**：雄性C57BL/6小鼠行两步法5/6肾切除术（5/6 Nx）建立UCM模型。
3. **细胞外囊泡相关技术**：差速超速离心法提取PBMC-EVs；透射电镜和纳米颗粒追踪分析（NTA）鉴定EVs；DiR荧光标记EVs进行活体成像示踪；PKH67/PKH26标记EVs用于细胞摄取实验。
4. **分子生物学技术**：小RNA测序（smallRNA-seq）筛选差异miRNA；qRT-PCR验证miRNA表达；双荧光素酶报告基因实验验证miR-744-5p与IGF2R 3'-UTR及YY1与miR-744-5p启动子的结合；染色质免疫沉淀（ChIP）实验检测YY1与miR-744-5p启动子结合；蛋白质印迹（Western blotting）检测蛋白表达；免疫荧光和免疫组化（IHC）检测组织定位。
5. **药物-靶点互作验证**：表面等离子体共振（SPR）测定Sal B与YY1的结合动力学；细胞热转移分析（CETSA）和药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS）实验验证Sal B与YY1的直接结合。

**研究结果：**
**3.1 IS刺激的PBMC-EVs触发心肌细胞损伤**
通过条件培养基和EVs干预实验，发现IS刺激的PBMC培养基可直接诱导心肌细胞肥大、凋亡和炎症通路激活；而PBMC^IS-EVs被心肌细胞内化后同样引起上述损伤，且GW4869（外泌体生成抑制剂）可恢复损伤，证明PBMC-EVs是IS诱导心肌损伤的关键介质。

**3.2 PBMC^IS-EVs下调miR-744-5p表达**
smallRNA-seq鉴定miR-744-5p为PBMC^IS-EVs中下调最显著的miRNA，且主要存在于EVs内而非游离形式。跨孔共培养系统证实PBMC-EVs将miR-744-5p递送至心肌细胞。miR-744-5p过表达PBMC-EVs减轻心肌细胞肥大、凋亡及NF-κB/p38 MAPK通路激活，而敲低则加重损伤。UCM患者PBMC-EV-miR-744-5p水平显著低于健康对照组，且与LVMI呈负相关。

**3.3 IGF2R是miR-744-5p的靶基因**
通过三个数据库预测及双荧光素酶报告基因实验，证实IGF2R是miR-744-5p的直接靶基因。miR-744-5p过表达PBMC-EVs降低心肌细胞IGF2R表达，敲低则上调。拯救实验显示，IGF2R沉默可部分逆转miR-744-5p敲低PBMC-EVs诱导的心肌细胞肥大、凋亡及NF-κB通路激活。在5/6 Nx小鼠中，DiR标记的PBMC^IS-EVs优先聚集于心脏组织，且静脉注射miR-744-5p过表达PBMC-EVs可下调心脏IGF2R、减轻心肌肥大、改善心功能、抑制NF-κB/p38 MAPK通路及减少凋亡。

**3.4 Sal B通过增强PBMC-EVs中miR-744-5p表达发挥UCM治疗作用**
Sal B处理上调PBMC^{IS+Sal B}-EVs中miR-744-5p表达，逆转miR-744-5p敲低引起的IGF2R上调和心肌细胞损伤。在5/6 Nx小鼠中，Sal B上调血清EVs中miR-744-5p、下调心脏IGF2R，减轻心肌肥大、改善心功能、抑制NF-κB/p38 MAPK通路及减少凋亡；而同时注射miR-744-5p敲低PBMC-EVs可显著减弱Sal B的保护作用，证明Sal B主要通过上调PBMC-EV-miR-744-5p发挥心脏保护效应。

**3.5 Sal B通过结合PBMCs中的YY1调控miR-744-5p/IGF2R轴**
生物信息学预测及双荧光素酶报告基因实验显示YY1结合miR-744-5p启动子并负调控其转录。ChIP实验证实Sal B处理减少YY1与miR-744-5p启动子的结合。分子对接和SPR实验表明Sal B直接与YY1结合（KD≈3.95×10^-6 M）。CETSA和DARTS实验验证Sal B结合后降低YY1热稳定性但增强其抗蛋白酶活性。在PBMCs中过表达YY1降低miR-744-5p表达，Sal B可逆转此效应；而YY1敲低与Sal B联用无协同作用，提示Sal B通过结合YY1上调miR-744-5p是保护心肌细胞的关键机制。

**讨论与结论：**
讨论部分指出，本研究首次揭示了PBMC-EVs在UCM中通过miR-744-5p/IGF2R轴介导PBMC-心肌细胞通讯的免疫病理机制。miR-744-5p在多种疾病中具有调控作用，其下调与UCM患者心肌肥厚相关，提示PBMC-EV-miR-744-5p可能作为UCM的新型诊断标志物，但需更大规模临床研究验证。Sal B通过直接结合转录抑制因子YY1，解除其对miR-744-5p的转录抑制，上调PBMC-EVs中miR-744-5p表达，从而减轻心肌损伤。该研究为UCM治疗提供了新的免疫机制靶点，并提示靶向PBMC-EVs修饰的天然药物策略具有临床转化潜力。

**研究结论：**
综上所述，研究人员阐明了UCM发展的新型免疫病理机制，建立了UCM治疗的新范式。研究结果表明，IS刺激降低PBMC-EVs中miR-744-5p表达，增加IGF2R水平，促进心肌细胞肥大、凋亡和NF-κB通路激活。此外，Sal B通过靶向结合PBMCs中的YY1，提高PBMC-EV-miR-744-5p水平，最终改善UCM。因此，研究人员提出使用Sal B抑制异常EV产生可能是治疗UCM的有效策略。