基于免疫亲和富集人血浆中神经系统细胞、肺肺泡细胞和肝细胞来源细胞外囊泡的方案

《Journal of Extracellular Biology》：Immunoaffinity-Based Protocol to Enrich Nervous System Cell-, Lung Alveolar Cell-, and Hepatocyte-Derived Extracellular Vesicles From Human Plasma

　　

通过保留源自源细胞的分子信息，细胞外囊泡（EVs）可作为组织健康或疾病的生物标志物，为液体活检应用铺平道路。从人体体液中富集组织特异性EVs（TS-EVs）可能因技术和方法学限制而具有挑战性。在此，研究人员采用单次和顺序免疫亲和捕获工作流程，富集人血液中循环的抗原特异性EVs。研究人员证明了该方法在富集来自神经系统、肺泡细胞和肝细胞的血浆EV亚群方面的特异性、效率和一致性。富集的亚群具有典型的EV特征和标志物，以及表面组织特异性和通用标志物的共定位。研究人员提供了一个经过验证的工作流程，可从循环中获取多种EV亚群，利用其作为组织状态信息性生物标志物的潜力，推动液体活检和生物标志物发现。

**论文解读：基于免疫亲和捕获富集组织特异性细胞外囊泡的方法开发与验证**

**研究背景与问题**
细胞外囊泡（EVs）是细胞分泌的膜限性小颗粒，携带蛋白质、核酸、脂质等分子，反映亲本细胞表型，可作为组织健康或疾病的生物标志物，尤其在液体活检中具有巨大潜力。然而，循环中大多数EVs来源于血小板和造血细胞，而来自其他组织（如神经、肺、肝）的EVs丰度较低，且存在表面标志物异质性、拓扑结构复杂性及与脂蛋白的非特异性相互作用等问题，导致组织特异性EVs（TS-EVs）的富集和表征面临技术挑战。现有方法缺乏标准化，限制了TS-EVs在临床研究中的应用。因此，开发一种可靠、可重复的免疫亲和捕获方案，以富集并验证来自不同组织的TS-EVs，对推动液体活检和生物标志物发现至关重要。

**研究内容与结论**
本研究开发并验证了一种基于免疫亲和捕获的工作流程，用于从人血浆中富集源自神经系统、肺泡I型细胞、肝细胞和胎盘滋养层细胞的TS-EVs。研究人员利用针对细胞特异性表面标志物的单克隆抗体（如GAP43/NLGN3、GLAST、TMEM119、HT1-56、AGER、GLUT2、ASGR1、PLAP），结合链霉亲和素修饰的磁珠，通过单次或顺序捕获策略，从少量冻存血浆中富集抗原阳性EV亚群。通过纳米颗粒流式细胞术（NanoFCM）、透射电镜（TEM）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和单EV超分辨显微镜（dSTORM）对富集产物进行表征，证实其具有典型EV特征（大小50–140 nm、形态、四跨膜蛋白表达）且低污染（低脂蛋白、白蛋白和钙联蛋白水平）。进一步通过检测组织特异性腔蛋白（如SYP、GFAP、AIF1、P2Y12、AQP5、NAPSA、CYP2E1、ASGR1、CYP19A1）验证了捕获特异性。结果表明，神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、肺泡I型细胞和肝细胞来源的EV亚群均显著富集相应标志物，且顺序免疫捕获（如GLUT2+/ASGR1+双阳性EVs）可提高肝细胞EVs的特异性。但胎盘滋养层细胞标志物PLAP未能有效富集。该研究为TS-EVs的系统性富集和验证提供了标准化方案，符合MISEV指南，发表于《Journal of Extracellular Biology》，具有重要方法学意义。

**关键技术与方法**
主要技术方法包括：①使用冻存人EDTA-K2血浆样本（健康捐赠者，BioIVT），对胎盘EVs研究使用确认怀孕捐赠者血浆；②通过超速离心（111,000 rcf，120 min）富集总EVs，再通过免疫亲和捕获（链霉亲和素磁珠偶联生物素化抗体）富集TS-EVs；③采用单次或顺序捕获策略（如肝细胞EVs依次靶向GLUT2和ASGR1）；④利用NanoFCM、TEM、ELISA和dSTORM进行EV表征；⑤通过ELISA检测组织特异性腔蛋白进行验证，以总EVs和IgG同型对照为基准。

**研究结果**
**3.1 一般EV表征**
通过NanoFCM和TEM分析，所有免疫捕获的EV亚群大小分布相似（50–140 nm），浓度约10⁸颗粒/mL，呈典型形态。ELISA检测到CD9、CD63、CD81，其中CD81在多数亚群中最高，但肝细胞来源亚群中CD63和CD9更丰富。免疫捕获EVs中ApoA1、ApoB100、白蛋白和钙联蛋白水平均远低于血浆和总EVs，表明低污染。

**3.2 经典与细胞特异性EV表面标志物的共定位**
单EV超分辨显微镜显示，GAP43/NLGN3、GLAST、TMEM119、HT1-56、AGER、GLUT2、ASGR1均与通用EV标志物（四跨膜蛋白组合、Pan-EV或CD9）共定位，但PLAP未观察到共定位。

**3.3 通过免疫测定验证免疫捕获EVs中细胞特异性蛋白表达**
**3.3.1 神经系统EVs**
GAP43+ || NLGN3+神经元EVs中SYP蛋白富集约237倍（vs IgG，p=0.008）；GLAST+星形胶质细胞EVs中GFAP显著富集（p=0.007）；TMEM119+小胶质细胞EVs中P2Y12（p=0.007）和AIF1（23倍，p=0.008）均显著富集。

**3.3.2 肺泡I型细胞EVs**
HT1-56+ EVs中NAPSA富集10倍（vs IgG，p=0.008），AQP5显著富集（vs IgG，p=0.007）；AGER+ EVs中AQP5显著富集（p=0.007），但NAPSA无显著差异；HT1-56+ || AGER+ EVs中NAPSA富集5.4倍，AQP5富集10.2倍，但主要贡献来自HT1-56。

**3.3.3 肝细胞EVs**
GLUT2+ EVs中CYP2E1富集3.3倍（vs IgG，p=0.008），ASGR1富集3倍（p=0.01）；ASGR1+ EVs中CYP2E1显著富集（vs IgG，p=0.007），ASGR1富集2.3倍（p=0.008）；GLUT2+ || ASGR1+ EVs中CYP2E1富集272倍（vs IgG，p=0.01），ASGR1富集5倍（p=0.008）；顺序捕获获得的GLUT2+/ASGR1+双阳性EVs中CYP2E1富集较单阳性亚群提高4.2倍，提高了特异性。

**3.3.4 胎盘滋养层细胞EVs**
PLAP+ EVs中CYP19A1水平与男性对照及未怀孕女性对照无显著差异，且未观察到PLAP与EV标志物共定位，表明该标志物无效。

**讨论与结论**
本研究建立并验证了从血浆中富集肺泡、肝细胞和神经系统EVs的标准化方法，首次报道了肺泡I型细胞EVs的富集与验证，并通过顺序免疫捕获提高了肝细胞EVs的特异性。研究确认了神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞EVs的组织特异性，但未支持PLAP用于胎盘EVs富集。该工作流程适用于少量冻存血浆，符合MISEV指南，为液体活检和生物标志物发现提供了可靠工具。结论部分翻译如下：总之，本研究提供了一种经过验证的方法，用于从血浆中富集肺泡、肝细胞和神经系统EVs亚群，推动广泛的EV基础应用。通过检查EV亚群中携带的分子信息，可获取难以触及的器官状态信息，避免侵入性组织取样。富集并验证的EV亚群是阐明急慢性肺和肝疾病的有力液体活检工具，而小胶质细胞EVs的验证可扩展至神经疾病研究。TS-EVs有望成为转化医学的突破性进展，从理解生物学机制到临床应用。建立该工作流程为深入研究TS-EV生物学、探索基于TS-EV的诊断和预后标志物、以及开发靶向药物递送系统开辟了新途径。