《Journal of Extracellular Biology》：Human Platelet-Derived Extracellular Vesicles Are Internalized by Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons Under Control and Hypoxic Conditions
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缺血性脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一。然而，目前的治疗方法具有有限的时间窗口和再生潜力。临床相关的人血小板来源的细胞外囊泡为脑卒中提供了潜在的神经保护治疗。研究人员通过共聚焦成像和使用Imaris软件的三维(3D)图像分析，证实了羧基荧光素琥珀
缺血性脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一。然而，目前的治疗方法具有有限的时间窗口和再生潜力。临床相关的人血小板来源的细胞外囊泡为脑卒中提供了潜在的神经保护治疗。研究人员通过共聚焦成像和使用Imaris软件的三维(3D)图像分析，证实了羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的EVs被神经元摄取。结果表明，人诱导多能干细胞来源的神经元能够内化EVs。研究人员还展示了EVs与细胞器：早期内体和溶酶体的共定位。研究人员使用体外人类脑卒中模型研究缺氧对神经元的影响。缺氧后，神经元的活动（包括尖峰和爆发）减少。然而，在再灌注72小时后活动恢复。EVs未对神经元活动产生急性影响，但在长期随访中，神经元表现出活动增加。总之，研究人员的发现在体外人类模型中提供了关于血小板来源的EVs对神经元摄取、形态和功能的影响以及缺氧损伤后变化的见解。
研究背景与意义
缺血性脑卒中是全球死亡和致残的主要原因之一，会导致核心区域缺氧与葡萄糖缺乏并引发大面积细胞死亡，而周围半暗带区域虽受损伤但仍有挽救潜力。目前的临床标准治疗包括溶栓和/或机械取栓辅以后续康复，但许多幸存患者仍遗留永久性残疾。尽管已有大量关于神经保护治疗的临床试验，但成功转化为临床应用的案例极少。近年来，来源于不同细胞的细胞外囊泡因其能穿透血脑屏障(BBB)并递送神经营养因子而备受关注，但迫切需要更具人类相关性的体外模型来评估其疗效。现有的体外脑卒中模型多依赖癌细胞系或啮齿动物原代细胞，基于人诱导多能干细胞来源神经元的模型虽极具潜力但仍属罕见。此外，针对血小板的临床血液样本已被验证安全，从中提取EVs用于治疗无需复杂的监管审批。为填补这些空白，研究人员开展了这项研究，探讨血小板来源的EVs能否被hiPSC神经元摄取、是否具有细胞毒性，并评估其对缺氧损伤后神经元功能和形态恢复的影响。该研究成功展示EVs的神经摄取、内体循环路径及对缺氧后长期恢复的潜在益处。本论文发表在国际细胞外囊泡领域权威期刊《Journal of Extracellular Biology》上，强调体外研究中长期随访的重要性。
关键技术方法
研究人员主要使用UTA.04511.Wts hiPSC细胞系分化的皮质神经元与芬兰红十字会血液服务中心提供的健康供者血小板浓缩物作为样本队列来源。采用差速超速离心法提取EVs，并用纳米颗粒追踪分析(NTA)、免疫印迹和成像流式细胞术进行表征。利用CFSE标记EVs后结合共聚焦显微镜和Imaris三维重建技术定量分析EVs的内化及与早期内体(EEA1)和溶酶体(LAMP1)的共定位。采用1%氧浓度的缺氧模型模拟缺血性卒中。通过微电极阵列(MEA)非侵入性记录神经元的放电与爆发等电生理功能，并结合免疫细胞化学(ICC)染色、乳酸脱氢酶(LDH)释放实验评估细胞形态与细胞毒性。
研究结果
人iPSC来源的神经元内化EVs
通过共聚焦成像和Imaris软件对三维图像进行量化分析表明，hiPSC来源的神经元在对照条件下能够成功内化CFSE标记的EVs。在1至8小时的追踪期内，EVs的内化比例从64%下降至47%，但EV体积占神经元总体积的比例从0.3%上升到0.8%。早期内体标记物EEA1与EVs的共定位率随时间从12%降至3%，溶酶体标记物LAMP1的共定位率从11%降至2%，显示了EVs在内吞处理过程中的时间变化特征。
在对照条件下EVs对细胞毒性、神经元形态和功能影响轻微
在体外第14天(DIV14)进行EVs干预，乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性测试、活/死细胞染色及Cl-Casp3凋亡检测结果显示，24小时EVs治疗后细胞凋亡无明显差异，也未引起严重代谢毒性。相较于对照组，接受EVs干预的神经元网络总体积显著增加，但三维重建显示整体形态分布相似。微电极阵列(MEA)功能记录显示，在急性期(96小时内)，EVs并未改变神经元的放电率，仅在24小时时表现出爆发率维持基线水平的轻微趋势，表明EVs在正常状态下对神经功能影响轻微。
缺氧不增加神经元对EVs的内化量但影响其与细胞器的共定位
在缺氧(1% O2)8小时后，神经元对EVs的内化比例和体积分数与对照组基本一致。然而，在缺氧条件下，EVs与EEA1的共定位率显著从1.8%升至7.0%，与LAMP1的共定位率也从2.1%显著升至6.1%。结果表明缺氧虽未改变神经元内化EVs的数量，但改变了其在细胞内的处理通路，增强了其经由内吞溶酶体途径的共定位。
缺氧对神经元的放电和爆发产生影响
形态学分析显示，8小时缺氧引起部分细胞凋亡比例增加，细胞核球形度轻微降低，但LDH活性无明显变化；在24小时缺氧初期LDH活性出现轻微短暂下降但在再灌注恢复。MEA功能记录显示，24小时严重缺氧导致神经元放电率急性剧降至基线的21.5%，爆发率几乎降为零。经过24小时再灌注后，放电与爆发活动仍显著低于对照组。但在72小时再灌注后，放电和爆发活动完全恢复至基线水平，表明该模型高度模拟了半暗带区域神经元受损后具有自发可逆恢复潜力的特征。
在缺氧条件下EVs对急性细胞毒性、神经元形态或功能无显著影响
在缺氧期间或再灌注初期，分别于缺氧前后给予EVs治疗。LDH活性测定与形态学分析显示，8小时缺氧和再灌注48小时期间，EVs治疗组与未治疗组均无显著细胞毒性或形态学差异。短期电生理记录表明缺氧使得放电和爆发均下降，而EVs预处理组在24小时缺氧后保留了轻微的爆发活动。但在48小时再灌注初期，无论是EVs预处理还是后处理，均未对神经元放电和爆发产生显著改善，且各组爆发间隔时间也无统计学差异。
EVs的长期效应倾向于在两周再灌注后增加活动
对神经元进行两周的MEA长期记录显示，在经历24小时缺氧后所有组的活动均大幅下降，但一周后皆恢复至基线水平。令人瞩目的是在治疗两周后，未加EVs的单纯缺氧组放电与爆发活动维持在基线附近，而接受EVs治疗的神经元网络展现出明显的活动增强：前处理组放电率升至基线的173%，爆发率升至181%；后处理组放电率升至175%（具统计学显著差异），爆发率升至312%。这证实了EVs对缺氧后长期功能恢复具有潜在的调节和促进效应。
讨论与结论总结
研究人员首次证明hiPSC来源的人类神经元能够内化血小板来源的EVs，并在常氧及缺氧状态下定位于早期内体和溶酶体中。缺氧虽不改变摄取量但增加了与内吞溶酶体的共定位，提示EVs在细胞内处理机制上的微环境依赖性。此外，本研究证实，利用hiPSC神经元结合24小时缺氧构建的体外脑卒中模型，能表现出类似半暗带受损区的高可塑性特征和自发功能恢复潜力。在短期急性干预中，EVs未显示出细胞毒性，且对细胞功能无显著负面影响。最关键的发现是在两周的长期随访中，缺氧前或后给予EVs均能显著增强神经元的放电和爆发活动，这表明血小板来源EVs不直接对抗原发性急性缺氧损伤，而是通过潜在的长期作用机制促进神经元网络的功能恢复。总而言之，本研究强调了采用功能性人源体外模型和延长随访时间在神经保护研究中的必要性，为血小板来源的EVs作为脑卒中神经治疗手段的临床转化提供了有力的体外数据支持。
