综述：尿素循环功能研究在临床前研究中的作用

《Journal of Inherited Metabolic Disease》：The Role of Urea Cycle Functional Studies in Preclinical Research

　　

影响尿素循环的先天性代谢错误是罕见的严重疾病，由氮解毒障碍引起，导致高氨血症（hyperammonemia）和广泛的临床谱中的神经系统疾病。当前的生化诊断主要依赖于代谢物的定量分析。虽然这些快照式读数对于诊断和急性管理不可或缺，但它们高度依赖外部因素，并且通常无法反映代谢补偿状态下的尿素循环功能，从而限制了它们在疾病分层、治疗监测和治疗方法临床前评估中的实用性。在此，研究人员反思了基于[15N]标记氯化铵（[15N]NH₄Cl）给药的尿素生成功能测定（functional ureagenesis assay）的原理、开发和应用，该测定能够定量评估体内总尿素循环功能。该测定的开发是由一项基因治疗处理的鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症（ornithine transcarbamylase deficiency, OTC deficiency）小鼠模型中的不一致生化和表型发现所推动的，在该模型中，超生理的酶活性并未转化为临床改善。研究人员证明，基于[15N]同位素的尿素生成测定（[15N]-isotope based ureagenesis assay）适用于体内模型，并能够检测尿素循环的功能校正。重要的是，研究人员展示了其在受尿素循环障碍（urea cycle disorders, UCDs）影响的代谢稳定个体中的适用性，在这些个体中，尽管存在显著的酶或转运蛋白损伤，但经典生化标志物通常正常。总之，这些数据确立了基于[15N]氯化铵的功能性尿素生成测定（[15N]ammonium chloride-based functional ureagenesis assay）作为量化尿素循环功能的稳健且敏感的工具。该方法为临床前研究和转化研究提供了明显优势，特别是在评估传统生物标志物缺乏区分能力的新治疗策略时。

1 Introduction
先天性代谢错误（inborn errors of metabolism, IEMs）影响尿素循环（尿素循环障碍，urea cycle disorders, UCDs）是一组罕见的严重疾病，以氮/氨解毒障碍为特征，临床谱从严重的早发性高氨血症到代偿性成人发病的轻微神经认知表现。传统上，UCDs的生化评估依赖于代谢物如氨（ammonia）、谷氨酰胺（glutamine）、瓜氨酸（citrulline）、精氨酸（arginine）、精氨酸琥珀酸（argininosuccinate）和尿乳清酸（orotic acid）的定量。这些测量对于快速诊断和急性管理不可或缺，但通常在单一时间点进行，仅提供高度动态代谢途径的快照。在代偿状态下，尽管尿素循环的六种酶或两种转运蛋白存在严重缺陷，代谢物水平可能仍处于正常范围。代谢物浓度与途径功能之间的这种分离限制了评估疾病严重程度、监测治疗效果或评估临床前干预的能力。对可靠生物标志物的需求对于评估新疗法（如小分子调节剂、mRNA疗法、基因替代和基因组编辑）尤为重要，这些疗法通常首先在代谢稳定个体中进行临床试验。本研究源于对spf^ash小鼠（一种广泛使用的UCD模型，即鸟氨酸氨甲酰转移酶（ornithine transcarbamylase, OTC）缺乏症）的真实实验室观察。尽管基因递送后肝脏匀浆中OTC酶活性超过生理水平，但未观察到表型改善。这凸显了经典生化测定的局限性，并促使了功能性测定（后称为尿素生成测定，ureagenesis assay）的开发，该测定能够定量代谢稳定状态下的体内总尿素循环功能。本文描述了基于[¹⁵N]标记氯化铵的尿素生成测定在临床前模型和人类受试者中的原理、开发和应用，并展示了其在区分代偿性突变体与野生型动物、评估治疗干预、表征细胞模型以及评估经典生物标志物失效的代谢稳定患者中尿素循环功能方面的效用。

2 Limitations of Classical Biochemical Assessment of Urea Cycle Function
spf^ash小鼠是OTC缺乏症最常用的临床前模型之一，携带Otc-Arg129His错义变异，导致约5%–10%的残余肝OTC活性，且存在广泛个体间和个体内变异性。这些小鼠在应激或高蛋白挑战下表现出生化异常，但在标准实验室条件下大多保持代偿。在尝试恢复OTC功能时，spf^ash小鼠接受了编码密码子优化鼠Otc基因的载体的流体动力尾静脉注射。治疗数周后，肝脏OTC活性超过野生型水平100%，但未观察到临床和生化表型改善。组织学分析显示裸DNA载体几乎完全局限于中央静脉周围肝细胞，而尿素循环主要位于门静脉周围肝细胞。由于氨解毒受这种区域化严格调控，中央静脉区域的超生理OTC活性并未转化为尿素生成增加。这一观察凸显了所有UCDs共有的局限性：肝脏匀浆中的酶活性测定并不一定反映尿素循环功能。进一步对spf^ash小鼠的生化表征揭示了经典代谢物测量在评估尿素循环功能上的深刻局限性。氨是最常用的临床和临床前生化标志物，但在代偿spf^ash小鼠中其诊断价值极为有限。在标准饲养条件下5周龄时，突变体小鼠的血氨浓度与野生型同窝对照几乎无法区分。氨浓度因采血部位而异，尾静脉采血值低于隐静脉，且均受动物限制程度和处理应激的影响。此外，氨表现出明显的昼夜节律，野生型和突变体小鼠在光照期开始时浓度较高。这些观察表明，spf^ash小鼠的氨水平受采样条件和生理状态强烈影响，而不仅仅取决于OTC缺乏症本身。乳清酸（orotic acid）作为另一个常用生物标志物，在组间比较中显示统计学显著差异，但个体间重叠很大，许多突变体小鼠乳清酸浓度直接落在野生型范围内。纵向采样显示显著的个体内变异性，即使在没有饮食或环境扰动的情况下，乳清酸水平也大幅波动。这些发现突显了经典代谢物评估在UCD临床前模型中的根本局限性：氨和乳清酸均缺乏区分代偿性突变体与野生型对照所需的敏感性和特异性，其高易受采样条件、生理波动和个体内变异性的影响，严重限制了它们评估治疗干预或量化残余代谢功能的效用，从而促使了功能性尿素生成测定的开发。

3 Development of a Novel Functional Ureagenesis Assay
尿素循环通过一系列酶促步骤将氨转化为尿素。给予[¹⁵N]标记氯化铵提供了途径的直接底物。在小肠吸收后，标记的氨通过门静脉运输至门静脉周围肝细胞，进入尿素循环并最终掺入[¹⁵N]尿素。标记与未标记尿素的质量差异（61 vs. 60 g/mol）可通过高分辨率质谱（high-resolution mass spectrometry, HR-MS）检测。该测定旨在提供一种稳健且生理上有意义的总尿素循环功能测量，适用于不同物种和实验系统，无需进行有创且不总提供信息的组织活检。在小鼠中，操作流程简单且微创，允许重复测量并兼容多种临床前研究。示踪剂[¹⁵N]氯化铵以0.4–4 mmol/kg体重的剂量腹腔注射，确保快速全身可用性，同时避免口服灌胃的变异性和风险。示踪剂给予后，在设定时间点（通常为30和60分钟）采集血液样本，每样本仅需5–10 μL全血，立即涂于滤纸并在室温干燥。干燥后样本具有显著生化稳定性，可在室温保存数天或在-20°C长期保存，而同位素完整性无可检测损失。[¹⁵N]尿素富集度随后通过HR-MS定量。在人类受试者中，该测定遵循类似概念框架，但增加了适合临床研究的程序性保障。参与者禁食4小时，放置外周静脉导管，示踪剂口服给予2 mg/kg体重，溶于20–50 mL自来水。在随后的2小时内，在预定间隔获取6个连续血样，建立个体化尿素生成时间曲线。该程序已在UCD患者中执行超过150次，健康对照中超过60次，耐受性良好，无显著不良事件报告。低示踪剂剂量、短测定时间和低侵入性使该方法适用于儿童和成人人群。

4 Advantages of This Ureagenesis Assay
该方法的中心优势在于其能测量总尿素循环功能，而非依赖可能受外部因素或补偿途径影响的孤立代谢物浓度。通过直接追踪标记氮掺入尿素，该测定捕获了循环内所有酶促和转运步骤的整合活性，提供了途径功能的完整评估。所需最少血容量（每时间点仅几微升）使其特别适用于小动物模型、新生儿研究和重复纵向测量。另一个实际优势是干血样本的卓越稳定性，便于分散样本收集、多中心研究以及通过普通邮件运输而无需冷链物流。该测定高度通用，不仅可在小鼠和人类中执行，还可在细胞系统中进行，将相同示踪剂加入培养基后定量上清液中标记氮的尿素掺入，允许直接比较原代肝细胞、干细胞衍生的肝细胞样细胞、永生化肝细胞系和基因修饰细胞模型之间的尿素生成能力。最重要的是，该测定足够敏感，可检测到经典生物标志物（如氨、谷氨酰胺或乳清酸）无法显示的部分缺陷和细微治疗反应，从而为临床前研究、转化研究和临床监测提供了生理基础性的代谢能力读数。

5 Functional Assessment in spf^ash Mice
将尿素生成测定应用于spf^ash小鼠，即使在经典生化标志物无法区分基因型的代谢稳定条件下，也揭示了突变体与野生型动物之间清晰且可重复的功能差异。野生型小鼠中，[¹⁵N]标记掺入尿素迅速，约30分钟达到最大富集，反映了完整尿素循环在氨到达门静脉周围肝细胞后立即捕获和解毒的高内在能力。相比之下，spf^ash小鼠表现出显著改变的动力学曲线：[¹⁵N]尿素富集显著延迟，初始标记速率相对于野生型对照显著降低，突变体动物显示缓慢且逐渐增加的标记尿素，约120分钟后才达到与野生型小鼠相当的水平，这与spf^ash小鼠中OTC活性的已知生化缺陷一致。30分钟时间点成为最具信息量的基因型区分指标。在此早期间隔，非禁食spf^ash小鼠仅达到野生型动物观察到的尿素生成量的约33%，提供了受损尿素循环功能的敏感定量测量。当动物在示踪剂给予前禁食时，功能缺陷更加明显，突变体在同一时间点仅达到野生型富集度的约19%。这些发现强调了营养状态对氮代谢的影响，并进一步凸显了该测定对调节尿素循环活性的生理变量的敏感性。重要的是，尿素生成测定揭示的功能损伤与经典代谢物测量所提示的生化正常性形成鲜明对比。

6 Application of the Ureagenesis Assay in Preclinical Studies
尿素生成测定在评估旨在通过不同策略纠正UCDs的基因治疗方法中特别有价值。一个示例是在Ass1^fold/fold小鼠（一种瓜氨酸血症I型亚等位基因模型，其特征为精氨酸琥珀酸合成酶活性显著降低和血浆瓜氨酸持续升高）中的应用。在这些动物中，采用体内AVV介导的基因添加或先导编辑来纠正潜在致病变异。虽然血浆瓜氨酸的降低提供了生化改善的初步指示，但尿素循环功能的功能评估提供了代谢挽救的生理有意义的测量。其他研究也证明了尿素生成测定在各种UCD动物模型中的应用，涉及多种治疗策略。

7 Application of the Ureagenesis Assay in Cellular Models
为将该测定扩展到整体动物研究之外，研究人员将其适应于体外系统。在此设置中，[¹⁵N]氯化铵直接加入培养基，标记氮在24小时孵育期内进入细胞代谢途径。对上清液的分析显示，不同肝细胞模型的尿素生成能力存在显著差异，反映了其内在代谢成熟度和尿素循环能力。原代人肝细胞表现出最高功能活性，示踪剂暴露后超过35%的总尿素池被标记。相比之下，诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）衍生的肝细胞尽管表达关键肝标志物，但仅显示很少的尿素生成，标记水平约5%。HepaRG细胞（一种常用肝细胞系，具有已确认的尿素循环功能）表现出中间性能，约8%富集。这些结果强调了该测定基于功能代谢输出而非单纯基因表达谱或分化替代标志物来区分细胞类型的能力，因此为评估肝细胞成熟方案、验证工程细胞系以及评估体外基因操作的代谢后果提供了有力工具。

8 Discussion
本研究的核心发现是，尽管经典代谢物测量对于UCDs的诊断和急性管理不可或缺，但它们在反映真实途径功能方面存在根本局限性。代谢物浓度代表产生、利用和排泄之间的稳态平衡，在UCDs中，这种平衡可受独立于潜在分子缺陷的因素深刻影响。残余酶或转运蛋白活性即使显著降低，也可能在基础条件下维持接近正常的代谢物水平；膳食蛋白质摄入和微生物组可掩盖或夸大生化异常；肾脏清除进一步增加变异性，且补偿性代谢途径（如谷氨酰胺合成、氨基酸转氨和清除剂提供的替代氮处理途径）可标准化循环代谢物。这些局限性强调了功能途径分析的重要性，它提供了根本不同类型的信息。尿素生成测定测量总途径功能，而非单一代谢物浓度，反映了尿素循环的实时实际能力，而代谢物浓度仅反映单一玩家在途径中的实际状态。通过直接定量标记氮掺入尿素，该测定捕获了尿素循环内所有步骤的整合活性，对部分缺陷、细微改善和肝功能区域差异具有内在更高的敏感性，并提供比代谢物测量更准确的治疗干预评估。与早期的示踪剂方法（如[¹³C]乙酸盐或[¹⁵N]谷氨酰胺）相比，该方法的优越性更加明显。[¹³C]乙酸盐的肝脏首过提取率极低（<1%），大部分示踪剂被呼出，导致大量示踪剂损失，且仅能定量标记尿素，无法提供中间代谢物或平行氮处理途径信息，且不能使用干血斑。相比之下，[¹⁵N]氯化铵的肝脏首过提取率超过50%，确保示踪剂直接递送至门静脉周围肝细胞，结合HR-MS的分析精度，使其成为研究尿素循环功能的优越工具。该测定的通用性使其适用于广泛的临床前研究环境，包括基因添加和编辑研究、新动物模型表征、肝细胞生物学和癌症生物学及免疫学。在临床研究中，尿素生成测定填补了传统生物标志物留下的关键空白，尤其在代谢稳定的UCD患者和意义不明确的突变患者中，功能测试可提供疾病严重程度见解，并支持更精确的分层和治疗监测。该测定已成为一项正在进行的临床试验（ClinicalTrials.gov NCT06488313）的次要结局指标。实际局限性包括需要仅在少数中心可用的HR-MS，以及[¹⁵N]氯化铵的不愉快味道可能降低患者依从性，但已证明其安全且不增加血氨浓度。总之，经典生化标志物对尿素循环功能的洞察有限，尤其在代偿状态或治疗干预期间，而基于[¹⁵N]氯化铵的尿素生成测定提供了稳健、敏感且生理相关的总尿素循环功能测量，适用于从小鼠到人类到肝细胞样细胞的多种物种和实验系统，并在多项临床前研究、细胞模型和临床评估中展示了效用。通过定量动态代谢功能而非代谢物浓度快照，该测定克服了传统生物标志物的局限性，为UCDs的临床前和临床研究提供了有力工具。