《Methods》：Sequencing of uterine fluid is a promising tool for predicting endometrial receptivity: a proof-of-concept study
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摘要背景子宫内膜接受度对成功妊娠至关重要。虽然可通过子宫内膜活检获得反映子宫内膜接受度的分子标志物，但该检测方法具有侵入性且结果出现较晚。因此，有必要建立一种侵入性更小、可靠性更高的方法来评估子宫内膜接受度，从而提升辅助生殖技术治疗的效率和效果。方法本研究于2021年6月至202
摘要
背景
子宫内膜接受度对成功妊娠至关重要。虽然可通过子宫内膜活检获得反映子宫内膜接受度的分子标志物，但该检测方法具有侵入性且结果出现较晚。因此，有必要建立一种侵入性更小、可靠性更高的方法来评估子宫内膜接受度，从而提升辅助生殖技术治疗的效率和效果。
方法
本研究于2021年6月至2022年3月在上海第一妇婴保健院辅助生殖中心开展。从223名最终实现临床妊娠的辅助生殖患者中，收集了胚胎移植后留在导管上的样本——其中3日移植时（推测为未进入接受状态，n=96）和5日移植时（推测已进入接受状态，n=127）。这些样本被进一步分为训练集（n=111份）和测试集（n=112份），用于构建和验证子宫内膜接受度预测模型。
结果
所有收集到的样本都含有足够量的总RNA可供后续分析。最终共鉴定出57个在上皮细胞和巨噬细胞中特异性表达的基因。在训练集中，该模型对子宫内膜接受度的预测曲线下面积为1.00，表明能够将未进入接受状态和已进入接受状态的样本完全区分开。在测试集中，该模型的AUC值为0.91，准确率为0.83，特异性为0.86，敏感率为0.79。
结论
本研究展示了一种非侵入性的子宫内膜样本采集方法，可用于准确判断子宫内膜接受度。
引言
近年来，由于婚姻状况变化、教育水平差异、不良生活习惯以及环境污染等因素，全球不孕症的发病率不断上升[1]、[2]、[3]，因此越来越多的夫妇选择通过辅助生殖技术来尝试怀孕[4]。人类胚胎着床是一个复杂的过程，需要胚胎与母体子宫内膜之间进行双向交流。黄体期时，性激素会促使子宫内膜结构和功能发生改变，这是胚胎着床的前提条件；若这一过程出现异常，则可能导致着床失败[5]、[6]。在胚胎移植之前，胚胎学家会对胚胎的形态和发育情况进行检查，筛选出质量最佳的胚胎[7]，但即便如此，胚胎着床率依然较低，仍是亟待解决的问题[8]。据估计，不良的子宫内膜接受度以及胚胎与子宫内膜之间的相互作用异常，导致了三分之二的着床失败案例[9]。因此，在胚胎移植之前，不仅需要淘汰质量不佳的胚胎，还需要检查子宫内膜是否适合胚胎着床。
子宫内膜接受度指的是子宫内膜发育到某一阶段时，滋养外胚层可以附着在子宫内膜上，并继续穿透子宫内膜上皮并侵入血管系统的状态[10]。子宫内膜接受度是卵巢类固醇激素作用的结果，必须与受精及胚胎发育过程同步，才能实现成功妊娠[11]。在大多数女性体内，子宫内膜在3到4天内具备接受优质囊胚的能力，这一时期被称为着床窗口期。但在部分女性身上，着床窗口期可能会发生变化或缩短，进而导致妊娠丢失或不孕（Neykova等人，2022年）。在体外受精-胚胎移植周期中取卵当日，如果子宫内膜存在形态异常，也会影响临床妊娠的成功率[12]。
目前用于评估子宫内膜接受度的各项指标，如子宫内膜下血流情况以及子宫内膜形态，其预测价值都比较有限[13]。传统上，临床评估子宫内膜接受度是通过Pipelle导管采集的子宫内膜活检样本进行组织学检查。但这种方法具有侵入性，不仅会延误生育治疗的进程，而且不同评估者之间的结果也可能存在差异。
在胚胎移植过程中检测子宫内膜环境时面临的一个难题是：如果在移植当天就检测子宫内膜，可能会干扰移植操作。因此，就需要采用非侵入性的方法采集子宫组织，以便评估子宫内膜的状况。在胚胎移植过程中，导管可以通过负压吸力采集子宫腔内的液体，同时一些子宫内膜细胞会附着在导管尖端。这些样本就可以用来监测子宫内膜的环境。目前已有研究致力于在胚胎移植当日利用导管采集子宫样本，以此研究子宫内膜的微环境，包括免疫环境[14]、微生物环境[15]等。研究表明，附着在导管上的细胞大多为子宫内膜细胞，可以从这些样本中获取与子宫内膜接受度相关的基因mRNA的表达信息[16]。通过检测从导管中采集的子宫腔液体样本，可以了解移植过程中子宫腔内T细胞和B细胞、中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞以及炎症因子的相对表达变化[14]。此外，导管上附着的样本还可以作为微生物检测样本，用于解释孕妇与未孕女性之间微生物构成的差异[15]。这些研究结果表明，利用导管采集的子宫腔和子宫内膜样本，确实可以反映移植当日的子宫内膜状态。
子宫内膜接受度的分子标志物可以通过传统技术（如组织学检测）或最新研发的技术（如子宫内膜接受度分析技术）来检测。子宫内膜接受度分析技术为利用分子标志物预测子宫内膜接受度提供了重要的理论基础和实践方法[17]、[18]、[19]，且其检测结果与组织学检测结果高度一致[20]。近年来的大规模临床研究显示，子宫内膜接受度分析技术显著提升了妊娠结局，比如临床妊娠率和着床率[21]、[22]。这些成果使得人们对子宫内膜接受度的分子标志物更加关注。因此，建立一种侵入性更小、可靠性更高的子宫内膜接受度检测方法，对于提升辅助生殖技术的效率和效果而言十分重要且必要。正因如此，我们开展了如下概念验证研究。
章节节选
样本采集与处理
本研究于2021年6月至2022年3月在上海第一妇婴保健院辅助生殖中心开展。研究对象为20至45岁、接受自体新鲜胚胎或冷冻胚胎移植的女性。患有先天性或继发性子宫异常，或是子宫内膜厚度低于8毫米的女性被排除在研究之外。关于辅助生殖技术以及胚胎移植前的子宫内膜准备方案，此前已有相关描述[23]。
研究设计
从223名实现临床妊娠的辅助生殖患者中，分别在3日（推测为未进入接受状态，n=96）和5日（推测已进入接受状态，n=127）采集了子宫内膜样本，研究设计如图1所示。这些样本被随机分为训练集（n=111份）和测试集（n=112份）。训练集包含48份3日采集的样本和63份5日采集的样本。研究人员利用训练集患者的RNA测序数据，构建了子宫内膜接受度预测模型，随后……
讨论
检测子宫内膜接受度对于确定辅助生殖技术中的胚胎移植时间具有重要意义，这也是生殖医学领域长期关注的焦点。在本研究中，我们采用非侵入性方法，对附着在胚胎移植导管上的子宫内膜细胞进行转录组测序分析，并结合随机森林算法构建了子宫内膜接受度预测模型。我们共鉴定出了57个在该样本中特异性表达的基因……
结论
总之，本研究创新性地利用附着在胚胎移植导管上的子宫内膜样本来评估子宫内膜接受度。通过对比未进入接受状态（3日采集样本）和已进入接受状态（5日采集样本）的RNA测序数据，我们找到了57个有助于预测子宫内膜接受度的特征基因，该预测模型的AUC值为0.91。我们的研究为开发非侵入性的子宫内膜接受度预测方法提供了思路。
伦理声明
本研究已获得上海第一妇婴保健院研究伦理委员会的批准（审批编号KS21247）。在样本采集之前，已从所有研究对象处获得了书面知情同意书。
CRediT作者贡献说明
陈苗欣：概念设计、研究方法设计、研究指导、论文撰写与修改。周丹：数据正规分析、论文初稿撰写、模型验证。邹扬云：概念设计、研究指导、论文初稿撰写。王宇：数据整理、数据正规分析。孙建妮：数据正规分析、研究调查。毛亚超：研究调查、研究方法设计。李团：数据整理、数据正规分析。陈玉琳：数据整理、数据正规分析。牛建宁：数据整理、数据正规分析。潘佳平：软件应用……
关于写作过程中生成式AI及AI辅助技术的声明
作者声明，在撰写本稿件时未使用任何生成式AI技术。
资金支持
本研究得到了以下机构的资助：上海市科学技术委员会的资助（项目编号23Y11909600），上海医院发展中心临床研究计划的资助（项目编号SHDC2020CR4080），以及国家自然科学基金委员会的两次资助（项目编号分别为81871213和81671468）。这些资助机构并未参与本研究的设计、样本采集、数据分析、结果解读，也未参与论文的撰写工作。
利益冲突声明
作者声明，本研究是在不存在任何可能被视为利益冲突的商业或财务关系的情况下开展的。
致谢
所有作者均感谢上海第一妇婴保健院和同济大学的支持，正是他们的帮助使得本研究得以顺利完成。
Miaoxin Chen|Dan Zhou|Yangyun Zou|Yu Wang|Jiani Sun|Yachao Mao|Tuan Li|Yulin Chen|Jianing Niu|Jiaping Pan|Yi Guo|Shanshan Liang|Mei Zhao|Kunming Li|Wenqiang Liu|Orhan Bukulmez|Yeung William Shu-Biu|Sijia Lu|Haixiang Sun|Xiaoming Teng
中国上海200092，同济大学医学院，上海胎儿医学与妇科肿瘤学重点实验室，上海第一妇婴保健院辅助生殖中心
