《Journal of Microscopy》：Bioimage analysis in deep visual proteomics: Advancing transparency, reproducibility, and FAIR principles
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深度视觉蛋白质组学（Deep Visual Proteomics, DVP）结合高分辨率显微镜、计算实例分割、激光捕获显微切割（Laser Capture Microdissection, LMD）及超灵敏质谱，实现对定义的细胞群进行空间分辨分子分析。在该流程
深度视觉蛋白质组学（Deep Visual Proteomics, DVP）结合高分辨率显微镜、计算实例分割、激光捕获显微切割（Laser Capture Microdissection, LMD）及超灵敏质谱，实现对定义的细胞群进行空间分辨分子分析。在该流程中，LMD通过物理分离显微镜定义的感兴趣区域以进行下游蛋白质组学分析发挥核心作用。然而，由于成像分辨率限制、组织制备变异性、激光切割参数及部分手动对齐程序，准确的图像到载物台转移仍具挑战。研究人员提出一种用于DVP的开源半自动图像到LMD互操作框架，集成基准标记检测、坐标变换及分割驱动的轮廓导出以实现可重复显微切割。以小鼠膀胱组织中中性粒细胞分离为代表用例，研究人员证明计算定义的细胞边界与LMD引导切除的稳健对齐。通过提升互操作性、透明度及流程标准化，该框架强化了显微镜与空间蛋白质组学的整合，支持空间定义免疫细胞群的可重复分析。
该研究发表于《Journal of Microscopy》。当前深度视觉蛋白质组学（Deep Visual Proteomics, DVP）作为空间蛋白质组学领先方法，其核心流程依赖高分辨率显微镜图像的细胞分割与边界检测、空间基准标记（fiducial marker）向LMD软件通信，以及LMD精确切除选定结构用于下游蛋白质组学分析。然而现有DVP初始实现依赖半手动图像制备和专有LMD对齐接口，缺乏开放获取与互操作性框架，图像到载物台转移的精度受成像分辨率、组织制备变异、激光参数及手动对齐限制，成功依赖生物图像分析与LMD的无缝自动化整合，而标准化、互操作性与方法透明度不足构成瓶颈，且需遵循FAIR原则（可发现、可访问、可互操作、可重用）以提升可重复性。为此研究人员开展开源半自动图像到LMD互操作框架研究，重构DVP流程，以小鼠膀胱中性粒细胞分离为用例验证其稳健对齐与可重复性，结论为该框架通过开源代码、版本控制、持久标识符及标准化XML坐标交换满足FAIR原则，通过详细元数据与协议报告支持可重复性，降低技术壁垒并确保定量空间蛋白质组学所需方法严谨性，推动DVP广泛应用。
研究人员采用的关键技术方法包括：使用6至8周龄雌性C57BL/6J小鼠（购自Charles River Laboratories）建立尿路感染模型（UPEC菌株536感染），获取小鼠膀胱组织并制备8 μm冷冻切片；进行DAPI核染色与Ly6G中性粒细胞荧光标记免疫荧光染色；采用Cellpose-SAM（v4.0.7）以细胞概率阈值0.8进行细胞分割，结合强度与重叠过滤；通过快速傅里叶变换（Fast Fourier Transform, FFT）卷积进行T形基准标记自动检测；利用pyLMD（v1.0.0）将过滤后细胞轮廓与基准标记导出为XML文件；导入Leica LMD软件（v8.4.0.8759）于Leica LMD7系统以特定激光参数（功率20、孔径1、速度4、中脉冲计数2、末脉冲1、头电流70%、脉冲频率2100 Hz）执行显微切割与收集。
研究结果部分保留原文小标题并依原文浓缩如下：
2 RESULTS AND DISCUSSION
2.1 Overview of the DVP pipeline and the open-source re-implementation
研究人员概述DVP为从复杂环境测量精确切割的单细胞或微组织区域蛋白质组（图1A），强调高分辨率显微镜、计算分割与LMD整合。提供半自动流程优化细胞分割、边界检测与通过基准标记注册图像，以小鼠膀胱中性粒细胞精确可重复切除为代表用例，表明该细化框架可半自动可重复应用于其他免疫或空间受限细胞群。
2.2 Segmentation and cellular boundary determination
准确细胞分割对DVP至关重要，边界误差会传导至下游切除与分析。免疫细胞如中性粒细胞因形态复杂与环境异质难分割。研究人员采用未微调Cellpose-SAM对Ly6G与DAPI染色的小鼠膀胱组织切片进行中性粒细胞分割（图1B、C），因膜关联Ly6G染色扩大表观边界，将Cellpose-SAM细胞概率阈值提升至0.8，经人工检查验证分割质量，实现组织中中性粒细胞检测与分割。
2.3 Instructions for interfacing with LMD instrument to excise neutrophils from tissue
现有LMD接口常依赖专有软件，存在互操作与可重复障碍及错配风险。研究人员建立标准化流程，在获取荧光图像前用LMD激光在组织切片烧录三个T形基准标记（T1、T2、T3）呈直角三角形（图1D），通过FFT卷积自动检测T形干条交点以降低手动偏差（图1E）。基准标记与分割细胞形状经pyLMD导出为XML导入LMD软件对齐数字图像与物理载片，经H&E染色检查潜在切割并执行中性粒细胞切割（图1F），切割后经H&E成像（图1G）与收集管显微镜验证形态完整性（图1H），详述元数据以确保通用性与可重复性。
3 CONCLUSION AND OUTLOOK
研究人员总结该半自动流程可实现组织切片单细胞激光显微切割精确可重复切除中性粒细胞，即便在结构有序异质组织中亦可。Cellpose-SAM对稀疏或形态明确群体分割稳健，但在高度复杂架构、密集细胞环境或大 multicellular 区域准确性可能下降，需微调、人工校正或替代策略。流程适配其他组织需调整分割参数、强度阈值及可能微调模型，XML导出层模块化可扩展至替代LMD坐标模式。与ShapeUpLMD及OpenDVP/QuPath-to-LMD不同，该流程聚焦FFT模板匹配自动基准检测，整合分割过滤、坐标注册与XML导出为统一Python基流程，独立于专有软件与手动注释，提供端到端开放框架。定性验证显示轮廓与目标细胞对齐稳健，未来需系统基准测试不同组织与LMD平台的对齐精度、污染率与切割精度。流程通过GitHub版本控制库（Apache-2.0许可）、Zenodo持久DOI存档、WorkflowHub注册Jupyter基工作流满足FAIR原则；通过XML标准交换图像轮廓与坐标支持Leica LMD软件互操作；通过开源许可、版本历史、安装说明、依赖规范、可配置参数、示例数据与详细实验元数据支持可重用与可重复性。未来方向包括开发图像到LMD通信开放标准接口、改进复杂组织用户引导细化的泛化分割模型、链接成像元数据与蛋白质组读数的FAIR兼容流程，推动DVP成为揭示健康与疾病细胞多样性的稳健自动化工具。
4 METHODS 部分依原文简述：动物研究经地方审查委员会批准，使用6至8周龄雌性C57BL/6N小鼠于无特定病原体条件饲养；尿路感染模型以UPEC菌株536培养并经尿道接种感染小鼠次日牺牲；工作流程依次为LMD激光烧录T形基准、获取荧光显微图像、Cellpose-SAM分割、强度与重叠过滤、FFT模板匹配检测基准、py-lmd导出轮廓坐标为XML、导入Leica LMD软件、对齐基准并执行切除、显微镜验证切除；免疫荧光显微镜以感染膀胱新鲜冷冻切片固定后直接偶联Ly6G抗体与DAPI复染封片；成像与LMD以Axio Scan Z.1获图，H&E快染后于Leica LMD7系统以指定激光参数切割收集至LoBind管；细胞分割与LMD准备中对DAPI与Ly6G图像对比度拉伸与归一化后以Cellpose-SAM阈值0.8分割，过滤平均Ly6G强度≥0.35且≥95%空间重叠Ly6G阳性像素（>0.2）的细胞，经两名独立研究者审查；基准检测对图像自荧光归一化、强度反转、自适应直方图均衡化后再反转，以FFT卷积（SciPy fftconvolve）匹配T形模板，取peak_local_max前三峰值提取交点，经py-lmd导出XML。
讨论总结与研究结论翻译部分依原文浓缩：研究人员在结论中指出，研究展示半自动流程分割显微图像以激光显微切割组织切片单细胞，精简流程证明即便在结构有序异质组织中也可精确可重复切除中性粒细胞。虽然Cellole-SAM对单个细胞分割稳健，尤其在稀疏或形态明确如中性粒细胞群体，但在高度复杂组织架构、密集细胞环境或大 multicellular 组织区域分割准确性可能降低，此类情况需额外模型微调、人工校正或替代分割策略。这些方法论细化旨在降低污染风险，提升计算定义边界转化为物理显微切割路径的保真度，减少图像到载物台对齐的用户依赖性变异。流程适配其他组织主要需调整分割参数、强度阈值及依标记分布与组织形态可能微调分割模型；XML导出层模块化或可扩展支持替代LMD坐标模式。近期图像到LMD互操作工具如ShapeUpLMD与OpenDVP/QuPath-to-LMD通过轮廓优化与注释区域导出推进领域，相比之下研究人员流程聚焦通过FFT基模板匹配自动基准检测，整合分割过滤、坐标注册与XML导出为统一Python基流程，独立于专有图像分析与手动注释，以端到端开放框架补充现有方案。定性验证证明导出轮廓与目标细胞稳健对齐，未来研究应系统基准测试不同组织与LMD平台的对齐精度、污染率与切割准确性。研究人员通过互补公共软件与工作流存档使流程符合FAIR原则：源代码以Apache-2.0许可发布于版本控制GitHub库，存档于Zenodo含持久DOI的可引用版本发布；可执行工作流注册于WorkflowHub描述为稳定Jupyter基工作流含工作流级元数据与持久工作流DOI，通过FAIR导向基础设施支持发现与重用；互操作性通过基于标准的图像衍生轮廓与坐标以XML文件交换导入Leica LMD软件支持；合格引用相关软件组件（Cellpose-SAM、pyLMD、Pixi管理依赖、Zenodo数据集）记录计算环境与关联研究对象；可重用与可重复性进一步由开放许可、版本历史、安装说明、显式依赖规范、可配置通道/参数设置、示例数据与详细实验元数据及协议报告支持。未来方向可包括开发图像到LMD通信开放存取标准与接口、改进复杂组织用户引导细化的泛化模型、链接成像元数据与蛋白质组读数的FAIR兼容流程，解决这些挑战可使DVP从有前景的概念演进为稳健自动化工具以揭示健康与疾病细胞多样性。
