《Microbial Pathogenesis》：A xanthone derivative MGS-3, confers protection against Staphylococcus aureus infection through SarA-mediated inhibition of alpha-hemolysin expression
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摘要耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的全球传播凸显出对新型治疗药物的迫切需求。本研究探讨了具有强效抗MRSA作用的半合成黄酮衍生物MGS-3的抗溶血活性及其作用机制。我们通过多层面方法，利用体外和体内模型评估了MGS-3对金黄色葡萄球菌α-溶血素生成的抑制作用。通过基因编辑、微尺度热泳技
摘要
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的全球传播凸显出对新型治疗药物的迫切需求。本研究探讨了具有强效抗MRSA作用的半合成黄酮衍生物MGS-3的抗溶血活性及其作用机制。我们通过多层面方法，利用体外和体内模型评估了MGS-3对金黄色葡萄球菌α-溶血素生成的抑制作用。通过基因编辑、微尺度热泳技术以及细胞热移变检测等机制研究，发现MGS-3直接作用于溶血素生物合成的关键转录调节因子SarA。MGS-3通过抑制hla基因的转录和表达，呈剂量依赖性地降低ATCC29213、USA300和NCTC8325菌株的Hla毒力。具体而言，它可下调sarA基因而不影响agrA基因，从而打破SarA与hla启动子的结合，进而降低Hla在A549和A375细胞中的细胞毒性。在体内实验中，MGS-3使皮肤脓肿中的细菌负荷减少了2.1倍，与ΔsarA处理的2.3倍效果相当，同时还能减轻细胞因子反应并改善组织病理状况。这些结果表明，抑制SarA是MGS-3发挥抗毒力作用的主要机制。值得注意的是，MGS-3的溶血活性较低，这体现了其作为治疗药物的良好潜力。MGS-3有望成为抗葡萄球菌药物开发的候选分子，通过针对病原体的毒力而非存活能力来遏制耐药性的发展。本研究为新型抗MRSA策略提供了药效学依据。
重要性
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的全球蔓延亟需新的治疗方法。半合成黄酮衍生物MGS-3通过靶向SarA调节因子来抑制α-溶血素的生成，从而降低其毒力。在鼠类皮肤脓肿模型中，MGS-3显著降低了细菌负荷并减轻了炎症反应。这种抗毒力策略为对抗MRSA提供了有希望的新途径。
引言
金黄色葡萄球菌是一种强大的革兰氏阳性病原体，它具有极强的生态适应性，能够定植于多种环境中，并在极端pH值条件下生存。由于抗生素的滥用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的全球传播速度加快，这使得人们更加需要加强对该病原体的管理并开发创新性治疗药物。该病原体的临床危害源于其进化出的多种毒力因子：能够破坏细胞膜的毒素（如α-溶血素/Hla、PVL）、能分解组织的酶（如凝固酶、透明质酸酶）、表面黏附蛋白（如蛋白A、聚集因子），以及强大的生物膜形成能力。这些毒力因子协同作用，可引发从轻微的皮肤脓肿到致命的侵袭性疾病，包括坏死性肺炎、心内膜炎和败血症等多种疾病。面对这一日益严峻的挑战，抗毒力疗法作为一种替代传统抗生素的策略应运而生。与传统抗菌药物不同，后者通过针对细菌的核心功能而对其施加强烈的进化压力，而抗毒力干预则精准地干扰致孔毒素的组装、群体感应信号通路、生物膜结构的稳定性以及病原体逃避宿主免疫系统的机制。这种从彻底消灭微生物转向减弱其致病性的策略优势明显，既能降低耐药性发展的选择压力，又能保护正常微生物群的平衡。
α-溶血素是金黄色葡萄球菌重要的毒力因子，它的激活过程十分复杂：最初以水溶性单体形式分泌出来，随后通过其前导结构域与ADAM10结合，进而引发构象变化，最终形成七聚体β桶状结构通道。这些直径为1-3纳米的跨膜通道会严重破坏细胞的渗透平衡。金黄色葡萄球菌的Hla基因表达受到多层调控网络的控制，其中包括agr群体感应系统、葡萄球菌辅助调节因子sarA，以及在宿主压力作用下激活毒力基因的SaeRS双组分系统。agr基因座会触发一系列磷酸化反应，AgrB会处理AgrD，生成能够激活AgrC-AgrA的自诱导肽。被磷酸化的AgrA又会进一步刺激P2/P3启动子，从而推动RNAII（编码agrBDCA）和RNAIII（一种非编码RNA效应分子）的表达。RNAII负责维持自诱导状态，而RNAIII则能在转录后水平上调节毒力因子的表达，它既能增强hla基因的翻译，又能通过反义配对抑制表面蛋白基因的表达。在所有调控因子中，SarA是一种由124个氨基酸构成的蛋白质，它具有独特的结构特征，包括五个α螺旋、一个β发夹结构以及一个C端结构域，它能通过三种由启动子产生的转录本来发挥作用：P1、P3和P2。SarA具有双重调控功能：一方面可以激活agr的P2启动子，进而增强RNAIII介导的hla基因表达；另一方面可以直接与hla启动子结合，无需agr的参与即可提升基因表达水平。正是这种双重功能，使得SarA成为整合群体感应信号和应激响应信号、调控病原体毒力的核心因子。
天然产物因其结构多样性、生物活性以及良好的安全性，成为了药物候选分子的丰富来源。目前已有多种从天然化合物中提取的Hla抑制剂被证明具有潜在的治疗作用，比如白藜芦醇、hispidulin和穿心莲内酯等。其中，来自山竹果的黄酮类化合物α-芒果素具有广泛的抗炎、抗癌和抗菌活性。不过，由于其缺乏选择性，容易破坏细胞膜，从而导致细胞毒性，限制了其在临床上的应用。为了解决这个问题，我们对α-芒果素进行改良，通过选择性地乙酰化其C-3位置的羟基，得到了MGS-3这一化合物。这一改良显著提升了该化合物的膜选择性，其溶血活性比α-芒果素低15倍，且差异具有极显著性；同时，其在体内的安全性也得到了提高，LD50值超过200毫克/千克。此外，MGS-3对A549细胞的IC50值大于25微克/毫升，而对正常LO-2细胞的IC50值为22.1微克/毫升，这说明它的安全性相当不错。基于我们之前的研究结果以及转录组数据，我们发现MGS-3对MRSA2具有很强的抗菌活性，同时还能显著降低金黄色葡萄球菌中与溶血相关的基因表达。因此，本研究旨在进一步探究MGS-3的抗毒力作用。
在本研究中，我们使用了三种金黄色葡萄球菌菌株：作为标准参考菌株的ATCC29213，毒力极强的社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300，以及用于研究溶血现象的NCTC8325菌株。我们通过多种方法系统地评估了MGS-3的抗溶血效果，包括溶血抑制试验、关键溶血相关基因的转录分析，以及各种分子和生化实验所揭示的作用机制。此外，我们还在体外（A549细胞和A375细胞）和体内（小鼠感染模型）环境中验证了MGS-3的抗毒力作用，同时确定了它在金黄色葡萄球菌毒力调控中的潜在作用靶点。
章节节选
细菌菌株、细胞系及试剂
金黄色葡萄球菌ATCC29213、USA300和NCTC8325均购自美国马纳萨斯市的美国典型培养物保藏中心，我们在37摄氏度、180转/分钟的条件下，将这些菌株培养在胰蛋白酶大豆肉汤中。△NCTC8325-sarA菌株由中国科学技术大学的李玉杰教授提供，而大肠杆菌BL21-pET28a-hla和BL21-pET28a-sarA菌株则是在Luria-Bertani培养基中培养的，同时还会加入50微克/毫升的卡那霉素作为抗生素。A549细胞（RRID编号：CVCL_0023）和A375细胞（RRID编号：
测定MGS-3对金黄色葡萄球菌溶血作用的抑制能力
黄酮类化合物α-芒果素及其衍生物MGS-3的结构如图1-A和1-B所示。首先，我们测试了MGS-3对细菌生长的抑制效果，这一结果为后续实验奠定了基础。与我们之前发表的研究结果一致，MGS-3对金黄色葡萄球菌ATCC29213和NCTC8325菌株的最低抑菌浓度均为2-4微克/毫升，而对临床分离株USA300的最低抑菌浓度则为4微克/毫升。如图1C-1E所示，
讨论
金黄色葡萄球菌是一种极具威胁的人类病原体，近年来其在临床上的危害越来越严重，主要原因在于它具有极强的抗菌药物耐药性发展能力，而且多重耐药菌株在医疗机构中的传播速度也非常快。这种病原体拥有强大的毒力武器库，包括能够形成孔道的细胞毒素Hla以及其他多种毒力因子。这些毒力因子共同作用，导致了多种不同的临床病症，范围
结论
综上所述，α-芒果素衍生物MGS-3在体外和体内环境中均表现出强大的抗金黄色葡萄球菌活性，且几乎不会产生细胞毒性。与直接抑制Hla功能的药物不同，MGS-3是通过SarA因子来调控Hla基因的表达，从而降低其毒力，这一作用并不依赖于Hla本身的活性或七聚体结构的形成。MGS-3不仅在亚最低抑菌浓度下就能发挥显著的抗毒力作用，而且其作用机制还可能具有多靶点抗菌的特性，
CRediT作者贡献说明
胡建刚：资源提供。魏敏：方法学研究。叶文冲：方法学研究。焦子瑞：资源提供。周文：论文撰写与修订、初稿撰写、资源协调、方法学设计、资金筹集工作。王晓阳：方法学研究。王春梅：论文撰写与修订、初稿撰写、项目管理工作、方法学研究、数据整理工作。Chandarajoti Kasemsiri：论文撰写与修订工作。白涵：论文撰写与修订、初稿撰写、项目管理工作，
伦理审批情况
所有动物实验均获得了中国农业科学院上海兽医研究所实验室动物伦理委员会的批准，审批编号为SV-20250221-G02。
利益冲突声明
所有作者均声明自己不存在任何可能影响本研究结果的利益冲突。
伦理审批情况
所有动物实验均获得了中国农业科学院上海兽医研究所实验室动物伦理委员会的批准，审批编号为SV-20250221-G02。
资金支持
本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号为32473084和U22A20518）以及中国国家重点研发计划（项目编号为2023YFD1800800和2023YFD1801301）的资金支持。
利益冲突声明
所有作者均声明自己不存在任何可能影响本研究结果的已知利益冲突或个人关系。
白涵|周月汉|叶文冲|胡建刚|魏敏|焦子瑞|唐群|葛日乐|吕赛|张科宇|王晓阳|Chandarajoti Kasemsiri|王春梅|周文
中国广西壮族自治区桂林市桂林医学院药学院临床药学系，邮编541199
