《Microchemical Journal》：Authentication of deer antler gelatin and quantification of hide- and bone-derived adulteration by LC–MS/MS using tissue-specific peptide markers
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•用于鉴定鹿角明胶以及检测皮革/骨头掺假物的LC–MS/MS分析方法。•通过统一的MRM方法，在10种偶蹄动物物种中实现了跨物种检测验证。•双重指标鉴定方式可避免在高程度掺假情况下出现误检。•市场调查显示，45批商业鹿角明胶产品中有48.9%存在不合格情况。引言鹿角明胶、鹿皮明胶
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用于鉴定鹿角明胶以及检测皮革/骨头掺假物的LC–MS/MS分析方法。
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通过统一的MRM方法，在10种偶蹄动物物种中实现了跨物种检测验证。
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双重指标鉴定方式可避免在高程度掺假情况下出现误检。
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市场调查显示，45批商业鹿角明胶产品中有48.9%存在不合格情况。
引言
鹿角明胶、鹿皮明胶和鹿骨明胶都是传统的动物源蛋白制品，是通过热水提取梅花鹿或红鹿的特定组织制成的[1]、[2]、[3]、[4]。尽管它们来自同一物种，但由于原材料的稀缺性，其价格差异较大。鹿角中明胶的提取率仅为20–35%[5]、[6]，而鹿皮和鹿骨作为大量的屠宰副产品，其成本不到鹿角的三分之一，且鹿皮中明胶的提取率可达80–95%[7]。这三种干燥后的产品外观上均为红棕色块状，难以通过感官鉴别，这就使得基于感官的鉴定方法无效。这种外观上的相似性加上价格差异，容易引发掺假行为，进而损害消费者信任并破坏公平竞争环境，因此亟需能够准确鉴定鹿角明胶并检测其中皮革或骨头来源掺假物的方法。
基于DNA的鉴定方法存在局限性，因为鹿的不同组织间序列相似度较高，且在高温处理过程中易发生降解[8]。传统的物理和化学鉴定方法也无法准确区分或测定组织的来源。而通过胰蛋白酶消化后利用质谱技术进行蛋白质组学特征肽分析，则为解决这一问题提供了方案，它能够在复杂的样本基质中实现目标肽的精准鉴定与定量[8]、[9]。不过，目前这项技术大多用于物种鉴定[10]、[11]、[12]、[13]。虽然已有研究报道了鹿角明胶与鹿皮明胶之间的差异肽，但仍存在一些问题：首先，与鹿角在理化性质上最为相似的鹿骨尚未被纳入研究范围[14]；其次，目前研究的偶蹄动物物种范围较窄，可能遗漏其他潜在的掺假来源；第三，缺乏大规模商业样本的验证，相关候选肽仍处于发现阶段。值得注意的是，若不建立系统的分析方法，可能会导致检测灵敏度不足或出现误检。我们之前的研究表明，基质效应会影响此类肽的直接MRM分析，为此我们采用了与基质匹配的校准策略，该策略成功通过了验证[11]。因此，目前迫切需要一种可靠的分析方法，能够覆盖常见的掺假物种、所有相关的组织类型（鹿角、鹿皮、鹿骨），并且经过严格的 方法学验证，以用于鹿角明胶的质量控制。
为满足这一需求，我们开发了一种LC–MS/MS分析方法，可用于鉴定鹿角明胶，并同时检测其中皮革和骨头来源的掺假物。该方法采用高分辨率数据依赖采集质谱技术配合无标记定量功能，对鹿角明胶、鹿骨明胶和鹿皮明胶进行蛋白质组学和肽组学分析。通过差异表达分析及直接丰度比较筛选出具有组织特异性的肽，再通过MRM技术在54批已知来源的样本中进行验证，随后在10种偶蹄动物物种（梅花鹿、红鹿、驯鹿、麋鹿、猪、马、牛、羊、驴、骆驼）中开展实验验证，以此确认这些肽的特异性及其在不同物种间的保守性，从而可实现针对主要掺假来源的快速检测。肽序列则通过合成标准品进行确认。最终，我们建立了完整的LC–MS/MS MRM分析方法，可用于鉴定鹿角明胶并定量检测其中的皮革和骨头来源掺假物，该方法已应用于45批商业鹿角明胶样本，用以评估其实际应用效果及当前市场的产品质量状况。
章节要点
仪器设备
蛋白质组学和肽组学分析是使用赛默飞世尔科技公司的Vanquish Neo Nanoliter LC系统搭配Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪（美国赛默飞世尔科技公司生产）进行的，该质谱仪由四极质量过滤器、Orbitrap质量分析器以及线性离子阱组成，同时还配备了Nanospray Flex?纳米喷雾电离源。目标肽的MRM分析则是使用AB Sciex公司的Triple Quad 6500+ HPLC-Triple Quadrupole MS系统（美国SCIEX公司生产）进行的。
样品中的明胶提取率
根据实验室制备的样本数据，鹿角的平均明胶提取率为29?±?4%，鹿骨为30?±?5%，而鹿皮的明胶提取率则高达86?±?2%，可见鹿皮的明胶提取率明显高于鹿角和鹿骨。
预处理条件的优化
优化结果总结见表S2。在溶解溶剂方面，所有标志肽在1%碳酸氢铵溶液中的响应值均显著高于纯水中的响应值，这是因为弱碱性环境有助于维持蛋白质的结构。
讨论
鹿角是哺乳动物中唯一具有再生能力的骨骼器官，其形成过程涉及表皮向骨骼的转分化[27]、[28]，因此其蛋白质组成兼具鹿皮和鹿骨的特征，这使得鹿角明胶与其他两种明胶难以区分。不过，我们的定量方法即便在没有定性信号的情况下，也能通过PepDBG-2和PepDHG-2这两种标志物识别出掺假情况。在10种物种中对PepDHG-3和PepDBG-2进行的跨物种验证，填补了现有方法的一个重要空白，因为此前的方法大多仅能实现二元区分（例如鹿角与鹿皮，或者牛源与...
结论
本研究开发了一种LC–MS/MS MRM分析方法，可用于鉴定鹿角明胶，并同时定量检测其中皮革和骨头来源的掺假物。与以往仅关注鹿角与鹿皮的区别且忽略鹿骨的研究不同，我们的方法通过整合蛋白质组学和肽组学分析技术，系统地涵盖了这三种组织类型。PepDHG-3和PepDBG-2这两种标志物已在10种偶蹄动物物种（梅花鹿、红鹿、驯鹿、麋鹿、猪、马、牛、羊、驴...
CRediT作者贡献说明
费雪：撰写——初稿、方法学、实验研究。 王冰：实验研究、数据整理。 焦阳：实验研究、数据整理。 崔伟良：资源准备、实验研究。 郭东晓：撰写——审阅与编辑。 林永强：撰写——审阅与编辑、项目指导。 李慧芬：撰写——审阅与编辑、项目指导、概念设计。 韩春超：撰写——审阅与编辑、项目指导、概念设计。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了山东省自然科学基金（项目编号：ZR2024QH059）以及中国国家重点研发计划（项目编号：2023YFC3504102）的资助。
费雪|王冰|焦阳|崔伟良|郭东晓|林永强|李慧芬|韩春超
