《Microchemical Journal》：Establishment of an immunoassay based on nobiletin nanobodies and its application in citrus fruits and herbal samples
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•筛选出了两种抗诺利宾纳米抗体；Nb-A2的灵敏度较高，IC??为211.15纳克/毫升。•基于Nb-A2开发的敏感型Nb-ELISA方法对13种诺利宾类似物的交叉反应率低于0.1%。•该Nb-ELISA方法能够准确检测柑橘类和中药材样本中的诺利宾。引言诺利宾是一种广泛存在于柑橘
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筛选出了两种抗诺利宾纳米抗体；Nb-A2的灵敏度较高，IC??为211.15纳克/毫升。
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基于Nb-A2开发的敏感型Nb-ELISA方法对13种诺利宾类似物的交叉反应率低于0.1%。
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该Nb-ELISA方法能够准确检测柑橘类和中药材样本中的诺利宾。
引言
诺利宾是一种广泛存在于柑橘植物中的多甲氧基黄酮，具有多种生物活性，在诸多领域具有广泛应用潜力[1]、[2]、[3]、[4]。研究表明，它的主要生物活性包括保护肝脏、抗癌、抗炎以及降血糖作用[3]、[5]。在代谢性疾病方面，诺利宾可改善高脂饮食引起的胰岛素抵抗，减少动脉粥样硬化斑块的形成[6]；同时还能通过降低脂肪沉积、缓解氧化应激失衡以及抑制炎症反应来改善非酒精性脂肪肝病的病理状态[1]。在癌症预防与治疗领域，诺利宾具有多种抑瘤功能，比如抑制肺癌细胞生长、引发程序性细胞死亡以及增强机体抗肿瘤免疫反应。值得注意的是，在某些情况下，其代谢产物的抗癌活性甚至可能强于母体化合物本身[7]、[8]。此外，诺利宾还对慢性萎缩性胃炎有缓解作用[9]。其分子结构中的多个甲氧基团能够增强电子离域效应，从而赋予其较强的抗氧化能力[10]，这一特性也为它的神经保护功能提供了机制依据[2]、[10]。
诺利宾具备多种药理活性，包括保护肝脏、抗炎、抗糖尿病、抗癌以及抗肥胖作用，这些特性为它在食品和传统中药领域的应用提供了科学依据[7]、[11]。在食品行业，它可以作为功能性食品成分或用于维护代谢健康及预防癌症的先导物质。在传统中药中，陈皮因含有丰富的诺利宾而备受重视，这类成分对于质量控制及药效学研究具有重要意义[12]、[13]。
目前，基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）或超高效液相色谱结合四极电场轨道阱串联质谱（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS）的分析方法已成为测定诺利宾含量的主要技术手段[13]、[14]、[15]。尽管这些方法在灵敏度方面优势明显，但在实际应用中也存在一些局限性，比如复杂基质带来的干扰、繁琐的样品前处理流程以及较高的仪器维护成本[16]、[17]、[18]。
利用抗原与抗体之间的特异性结合反应，免疫分析法具有极高的灵敏度和选择性，因此成为临床诊断、药物研究以及食品安全快速筛查等领域的重要分析工具[19]、[20]、[21]。其中，酶联免疫吸附试验（ELISA）因其操作简便且具备定量分析能力，在药物代谢研究、环境监测以及食品污染物检测中发挥着重要作用[22]。
近年来，纳米抗体作为一种新型的生物识别元素逐渐崭露头角，具有诸多显著优势。它们的分子量仅约为15千道尔顿，既能保持纳摩尔级的亲和力，又具备较高的溶解度和化学稳定性。纳米抗体的核心结构源自骆驼科动物产生的重链抗体可变片段VHH，这类片段包含CDR1、CDR2和CDR3三个互补决定区。与传统抗体结构不同，虽然纳米抗体的抗原结合界面较小，但它们可以通过增加表位内每个残基的相互作用次数以及框架区域的非特异性相互作用来提升结合亲和力。其较小的尺寸还使得它们具有更强的组织穿透能力[23]、[24]、[25]。此外，现有研究显示，纳米抗体在高温、极端pH值以及有机溶剂环境中仍能保持结构和功能稳定性，这有利于它们的储存和运输[24]。另外，通过在大肠杆菌和酵母等微生物系统中运用基因工程技术，可以低成本、短周期地高效生产纳米抗体。这项技术已被成功应用于复杂基质中多种食源性病原体及环境污染物的检测分析[19]、[26]、[27]。
虽然我们的实验室此前已经基于针对诺利宾的单克隆抗体建立了一种间接竞争性ELISA方法[28]，但单克隆抗体存在生产周期长且批次间稳定性不足的固有缺陷。相比之下，纳米抗体凭借出色的热稳定性和化学稳定性、高产量表达、低生产成本、易于改造以及广泛的适用性，成为了传统抗体的有力替代品。
目前，针对小分子的纳米抗体研究还相对较少。本研究成功筛选出了两种能够特异性识别诺利宾的纳米抗体，即Nanobody-A2（Nb-A2）和Nanobody-A5（Nb-A5）。此外，为了能够在实际样本（包括柑橘皮和传统中药材）中实现对诺利宾的定量检测，我们基于Nb-A2开发了一种基于纳米抗体的间接竞争性酶联免疫吸附试验系统，并将其应用于实际检测中。
章节要点
化学品与试剂
人工抗原诺利宾-BSA和诺利宾-OVA之前已由我们的实验室制备[28]。诺利宾（纯度≥99.71%）及其结构类似物，包括芦丁、橙皮苷、橙花苷、川陈皮素、柚皮苷、柚皮素、 Poncirin、橙皮苷、新橙皮苷、Didymin、埃里奥西特林以及Rhoifolin，均购自中国上海的安佩尔实验室技术公司。四环素则购自中国上海的阿拉丁公司。本研究中使用的带His标签的小鼠单克隆抗体来自
阳性单克隆噬菌体的生物筛选与蛋白质序列分析
我们团队此前曾用诺利宾-BSA结合物给小鼠接种疫苗，成功获得了针对诺利宾的特异性单克隆抗体，这证明了该结合物具有优异的免疫原性。在此基础上，本研究又用相同的结合物对羊驼进行了免疫。通过对羊驼血清的间接竞争性酶联免疫吸附试验分析（见表S1），证实了体内确实产生了针对诺利宾的抗体，这为后续研究奠定了重要基础
结论
在本研究中，我们用诺利宾-BSA对羊驼进行了免疫，并构建了一个噬菌体展示的纳米抗体文库。经过四轮生物筛选后，从该文库中成功获得了两种针对诺利宾的特异性纳米抗体，即Nb-A2和Nb-A5。随后我们基于这两种纳米抗体建立了间接竞争性ELISA方法——Nb-ELISA。其中Nb-A2的灵敏度更高，其IC??值为211.15纳克/毫升。该方法的特异性也非常好
CRediT作者贡献说明
曹春雷：论文撰写——初稿撰写、研究实施、正式分析、概念构思。孙峰：研究实施、数据整理。金志辉：研究实施、数据整理。侯雅静：方法设计、数据整理。高佳怡：方法设计、数据整理。赵启阳：方法验证、数据整理。何月：资源提供、资金获取。张耀海：资源提供、资金获取。崔永亮：论文撰写——审阅与编辑、项目监督、项目管理、方法设计、概念构思。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了中国农业研究体系专项基金（编号：CARS-26）以及西南大学研究生创新项目（编号：SWUS26168）的支持。
曹春雷|孙峰|金志辉|侯雅静|高佳怡|赵启阳|何月|张耀海|崔永亮
