通过纳米抗体靶向的TurboID探索CD38相关表面组

《Molecular & Cellular Proteomics》：Exploring the CD38-associated surfaceome via nanobody-targeted TurboID

　　

CD38是一种细胞表面糖蛋白，其分子功能与其周围的蛋白质环境密切相关。迄今为止，对CD38相关表面蛋白的组学水平理解仍然缺乏。为了研究活贴壁细胞培养中CD38近端表面组（surfaceome），研究人员开发了纳米抗体靶向的TurboID（NBID），这是一种使用感兴趣蛋白（POI）特异性纳米抗体-TurboID嵌合体（NTCs）的邻近标记方法，并应用该方法表征了细胞表面的CD38近端蛋白质组。该方法通过EGFR靶向的NTC构建体进行了验证，该构建体恢复了多个已知的EGFR相关蛋白。CD38特异性NTC被应用于A549肺癌细胞和THP-1单核细胞白血病细胞，并富集了多个参与粘附、细胞外基质（ECM）组织和脂筏相关膜域的蛋白质。在A549细胞中，与Wnt信号相关的蛋白也被额外富集。NAD⁺处理并未显著改变A549细胞中CD38近端表面组。全内反射荧光显微镜进一步证明了几个富集的候选蛋白与CD38在膜突起上的共聚集。功能实验表明，CD38有助于A549细胞的跨内皮迁移。通过将NBID与细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）相结合，研究人员进一步在肿瘤-内皮界面鉴定了涉及CDH2和DSG2的CD38相关钙粘蛋白粘附复合物。总之，这些结果确立了NBID作为在天然条件下研究表面蛋白环境和细胞间蛋白质邻域的强大平台。此外，研究人员的发现揭示了一个CD38相关的膜粘附网络，并为CD38在肿瘤细胞迁移和肿瘤-内皮相互作用中的作用提供了新的见解。

**论文解读：通过纳米抗体靶向TurboID探索CD38相关表面组**

**研究背景与问题**
细胞表面蛋白通过形成动态膜相关网络调控信号转导、粘附、迁移及细胞外基质（ECM）重塑等过程。CD38是一种多功能跨膜糖蛋白，兼具外酶和受体功能，参与免疫、代谢及肿瘤进展。然而，CD38的受体功能依赖于其与邻近膜蛋白的侧向关联，但对其在实体瘤中膜相关蛋白网络的系统表征仍属空白。现有邻近标记方法如BioID、TurboID需将标记酶与目标蛋白（POI）基因融合，可能扰动天然蛋白组织，且不适用于遗传操作受限的系统。因此，研究人员开发了一种基于纳米抗体的邻近标记策略——纳米抗体靶向TurboID（NBID），以在天然条件下解析CD38的膜蛋白微环境，并探究其与肿瘤细胞行为的关联。该研究发表在《Molecular》。

**研究方法概述**
研究人员主要采用以下关键技术：①构建并纯化CD38特异性纳米抗体MU1053与TurboID的融合嵌合体（NTCs），通过刚性富含脯氨酸的接头连接；②将NTC直接添加至活细胞培养物中，通过添加生物素、ATP和Mg²⁺引发邻近标记，随后进行NeutrAvidin亲和捕获和基于数据非依赖性采集（DIA）的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析；③结合稳定同位素标记（SILAC）与A549（肺癌细胞）和HUVEC-T1（人脐静脉内皮细胞）共培养系统，区分细胞来源的蛋白质；④使用全内反射荧光显微镜（TIRFM）验证候选蛋白与CD38的共定位；⑤利用Transwell跨内皮迁移实验评估CD38的功能。样本来源包括A549细胞、THP-1单核细胞白血病细胞及HUVEC-T1内皮细胞。

**研究结果**

**1. 纳米抗体-TurboID嵌合体（NTCs）的表达与验证**
研究人员设计了两种不同长度接头（P26和P8）的CD38靶向NTC，并在大肠杆菌中高效表达。通过CD38转染的HEK293T细胞验证，MU1053-P8-TurboID（P8接头）的标记效率更高（捕获/输入比约0.55 vs. 0.27），因此后续实验选用P8接头。

**2. NBID实现细胞培养中POI近端表面组的蛋白质组学定位**
使用EGFR靶向纳米抗体7D12构建的NTC在A549和HeLa细胞中进行验证。NBID分别鉴定出114种EGFR近端表面相关蛋白，其中33种为已知互作蛋白，表明NBID是可靠的工具。

**3. NBID揭示A549和THP-1细胞中CD38相关表面组**
在A549（野生型）和THP-1细胞中，分别鉴定出13种和6种（除CD38外）显著富集的表面可及蛋白，涉及细胞粘附、ECM组织和脂筏相关膜域。A549细胞中额外富集了Wnt信号受体FZD2/FZD7及SEMA3C。NAD⁺处理未显著改变CD38近端表面组（PERMANOVA，R² = 0.18，p = 0.5）。共同富集的蛋白包括PRNP、NECTIN2、MRC2和PLAU，提示CD38与粘附-ECM网络相关。

**4. CD38与NBID鉴定的互作蛋白在A549细胞表面共聚集**
TIRFM显示，NECTIN2、CDH2、FZD2、PRNP及CRIM1均与CD38在膜突起（类似丝状伪足或侵袭足）上共聚集，支持CD38参与膜微域组织。

**5. CD38介导的相互作用促进A549细胞跨内皮迁移**
使用HUVEC-T1单层Transwell模型，可溶性CD38蛋白预处理内皮单层后，A549跨内皮迁移显著减少11.0%（p = 0.034），表明CD38通过肿瘤-内皮界面相互作用参与迁移。

**6. NBID鉴定CD38相关的细胞间钙粘蛋白粘附网络**
在SILAC标记的A549-HUVEC-T1共培养中，NBID在A549来源（重通道）和内皮细胞来源（轻通道）中均富集了DSG2和CDH2，以及CTNNB1等。STRING网络分析显示这些蛋白形成物理互作网络，提示CD38在肿瘤-内皮接触中整合入钙粘蛋白介导的粘附复合物。PECAM-1未被检测到，可能因纳米抗体干扰或相互作用短暂。

**讨论与结论**
讨论部分指出，NBID方法扩展了现有邻近标记技术的应用范围，具有可规模化生产、简化流程、避免遗传操作等优势。局限性包括：表位遮蔽可能影响标记效率；背景信号可能限制低丰度蛋白的检测；需针对不同POI选择合适的对照设计。研究结论部分翻译如下：
总之，研究人员建立了一种基于POI特异性纳米抗体-TurboID嵌合体的邻近标记工作流程，并将其应用于肿瘤和免疫细胞模型中CD38相关膜蛋白网络的表征。研究结果揭示了细胞粘附、ECM重塑和Wnt信号相关蛋白的富集，鉴定了CD38相关的膜突起结构，并支持CD38在跨内皮迁移中的作用。通过将NBID与SILAC共培养蛋白质组学结合，研究人员进一步在肿瘤-内皮界面鉴定了含有CDH2和DSG2的CD38相关钙粘蛋白粘附结构。这些发现为CD38的膜相关功能提供了新见解，并确立了NBID作为研究内源性表面蛋白环境的通用平台。