《Molecular & Cellular Proteomics》：Proteoform Detection across 17000 Single Nuclei from Differentiating Skin Keratinocytes
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近期单细胞核RNA测序（snRNA-seq）的进展通过捕获稀有或难分离细胞类型的动态细胞状态和转录活性，展现了相较于单细胞转录组学的优势。为实现完整蛋白质谱中类似的增强，研究人员将单细胞蛋白质形成像质谱（scPiMS）应用于细胞核，对超过104
近期单细胞核RNA测序（snRNA-seq）的进展通过捕获稀有或难分离细胞类型的动态细胞状态和转录活性，展现了相较于单细胞转录组学的优势。为实现完整蛋白质谱中类似的增强，研究人员将单细胞蛋白质形成像质谱（scPiMS）应用于细胞核，对超过104个人类皮肤细胞进行无标记、蛋白质形分辨的分析。利用scPiMS，研究人员调查了约400个蛋白质形，来自从人类表皮角质形成细胞（跨越未分化增殖状态到分化状态）分离的超过17000个单细胞核，生成了表皮分化的单细胞核蛋白质形图谱。蛋白质形通过完整质量标签（IMT）匹配分配到从未分化（UD）和分化（DF）细胞核的批量自上而下液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析生成的参考蛋白质形库，随后应用单细胞核蛋白质形分配评分（PAScores）。单细胞核PiMS（snPiMS）数据的无监督聚类解析了12个不同的蛋白质形定义簇，跨越从未分化增殖状态到终末分化的连续谱。一个祖细胞富集簇（簇4）表现出升高的HMG-17、乙酰化H2A/H2B变体和H2A.Z，与开放和发育预备的染色质一致。一个早期分化群体（簇3）的特征是带有H3K4乙酰化以及H3K9单甲基化的组蛋白H3，指示转录激活。渐进性的组蛋白H4甲基化（H4K20me1、H4K20me2和H4K20me3）反映了在分化前祖细胞样细胞核中新合成H4的细胞周期偶联修饰，分别对应簇5、2和8。簇1富集了带有H3K4me3和H3K9me1的H3蛋白质形，与活跃但转录预备的染色质状态一致。分化承诺状态（簇0）表现出含有H3K4和H3K9乙酰化以及H3K36me2的H3蛋白质形，反映转录活跃的染色质。批量组蛋白翻译后修饰（PTM）谱证实了这些趋势，未分化细胞核富集H3K9me2和H4K20me1，分化的细胞核富集H4K20me2、H3K79me2、H3K27me2/3和H3K36me3。总之，snPiMS独特地解析了单个细胞核内的组合性组蛋白蛋白质形，揭示了跨表皮分化的连续染色质轨迹。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
单细胞技术的进步，尤其是单细胞RNA测序（scRNA-seq），通过高分辨率分子谱揭示细胞异质性，推动了生物学研究。然而，传统批量测序方法平均了异质细胞群体的信号，掩盖了关键细胞特异性变异。单细胞组学方法虽能克服此局限，但仍以转录组为主，蛋白质形（proteoform）信息——由基因变异、可变剪接和翻译后修饰（PTM）组合决定的功能效应分子——仍未充分探索。mRNA丰度与蛋白质水平在群体和单细胞尺度上均存在弱相关性，凸显直接蛋白质测量的必要性。现有单细胞蛋白质组学（SCP）基于“自下而上”肽段质谱（MS）方法，虽能定量蛋白质丰度，但受限于动态范围，且无法直接检测完整蛋白质形。单细胞核RNA测序（snRNA-seq）在复杂组织细胞分离困难时具有优势，但蛋白质形层面的单细胞核分析仍是空白。本研究旨在通过将单细胞蛋白质形成像质谱（scPiMS）扩展至细胞核，建立单细胞核蛋白质形成像质谱（snPiMS）平台，解析人类表皮角质形成细胞分化过程中核蛋白质形动态，特别是组蛋白翻译后修饰（PTM）的组合变化，以揭示染色质状态演变。
**研究内容与结论**
研究人员利用snPiMS对来自人类新生儿包皮角质形成细胞（来自6名匿名捐赠者，经西北大学伦理审查豁免）的未分化（UD）和分化（DF）状态的17000多个单细胞核进行高通量蛋白质形谱分析，平均每小时约50个细胞核。通过整合snPiMS数据，鉴定出约400个蛋白质形特征，并利用完整质量标签（IMT）匹配至批量自上而下液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）生成的参考库，结合蛋白质形分配评分（PAScore）进行单细胞核级分配。无监督聚类（Seurat）解析出12个蛋白质形定义簇，跨越从增殖祖细胞到终末分化的连续谱。关键发现包括：祖细胞富集簇（簇4）高表达HMG-17、乙酰化H2A/H2B变体和H2A.Z，体现开放染色质；早期分化簇（簇3）以H3K4乙酰化与H3K9单甲基化组合为特征，标志转录激活；渐进性H4K20甲基化（me1、me2、me3）在簇5、2、8中分别反映细胞周期偶联的新生H4修饰；簇1富集H3K4me3与H3K9me1共存的蛋白质形，对应活跃兼预备染色质；分化承诺簇（簇0）以H3K4/H3K9乙酰化与H3K36me2为特征，体现持续转录活性。批量组蛋白PTM谱（MRM LC-MS/MS）验证了上述趋势，未分化核富集H4K20me1、H3K9me2，分化核富集H4K20me2、H3K79me2、H3K27me2/3、H3K36me3。该研究确立了snPiMS作为蛋白质形层面单细胞核表型分析的新平台，为理解染色质状态动态、细胞周期偶联分化机制提供了分子证据，论文发表在《Molecular》。
**主要技术方法**
1. **单细胞核蛋白质形成像质谱（snPiMS）**：基于定制纳米解吸电喷雾电离（nano-DESI）源耦合至改进型Q Exactive Plus质谱（用于个体离子质谱I2MS），对固定于玻璃腔室玻片上的单细胞核进行扫描，以20 μm/s速率、200 μm线间距采集，工作溶剂为5%乙酸/57.5%乙腈/37.5%水。
2. **蛋白质形分配评分（PAScore）**：利用数学公式整合质量精度与同位素丰度，将单离子匹配至理论同位素包络，生成0-1的置信分数，用于单细胞核级蛋白质形鉴定。
3. **蛋白质形聚类与差异表达分析**：基于Seurat包对snPiMS数据进行归一化、主成分分析（PCA）、均匀流形近似与投影（UMAP）降维及K近邻（KNN）图聚类（分辨率0.2），并通过Wilcoxon秩和检验鉴定差异表达蛋白质形（FDR < 0.05）。
4. **参考蛋白质形库构建**：通过批量自上而下LC-MS/MS（包括毛细管电泳-MS/MS）分析UD和DF细胞核，生成完整质量标签（IMT）数据库，用于匹配snPiMS鉴定的蛋白质形。
**研究结果**
**单细胞核蛋白质形分析在祖细胞或分化状态角质形成细胞中的应用**
snPiMS工作流优化后实现约50个细胞核/小时的通量，从17,243个单细胞核（9,024个UD，8,219个DF）中检测到超过1.38亿个个体离子，其中50%以上成功电荷分配。聚合后鉴定出约400个质量特征，其中236个蛋白质形通过IMT匹配至参考库，检测深度受限于约200个蛋白质形，表明蛋白质形覆盖的主要约束是检测深度而非样本量。
**单细胞核在祖细胞和分化细胞状态中的蛋白质形景观**
UD和DF核的聚合I2MS谱显示核心组蛋白（H4、H3、H2B、H2A等）在11-16 kDa范围内的PTM模式总体相似，但存在细微差异，包括H4甲基化、H2A.Z乙酰化（+42 Da）及H3上甲基化/乙酰化组合。此外，检测到连接组蛋白H1、高迁移率族（HMG）蛋白（HMGN1-4、HMGA1）及核糖体亚基蛋白（后因非核特异性被排除）。
**单细胞核蛋白质形的分配评分**
利用PAScore框架，每个细胞核平均约200个蛋白质形具有非零评分，130个蛋白质形通过0.005阈值（估计FDR 5%）。每个蛋白质形平均分配10-15个单离子，典型PAScore范围0.2-0.95。UD核的总离子数和分配离子数略低于DF核，但趋势一致。
**基于蛋白质形的单细胞核聚类与细胞状态组成**
整合17个技术重复后，使用192个高度可变核特异性蛋白质形特征进行聚类，UMAP可视化显示12个离散簇（0-11）。簇0细胞比例平衡（DF/UD≈0.95），簇1和簇3偏向DF（簇3最强，DF/UD≈5.64），簇4显著偏向UD（DF/UD≈0.24），代表最大未分化基底核群体。簇2和5-11显示不同程度的UD富集（DF/UD≈0.55-0.85），对应中间和分化后状态。Sankey图展示了从簇4（祖细胞）到簇3（分化）的连续转变。
**蛋白质形特征定义角质形成细胞分化过程中的不同细胞状态**
差异表达分析（Wilcoxon秩和检验，校正p < 0.05，|log2FC| > 1）鉴定出170个独特蛋白质形。
- **簇5**：H4K20me1（伴K12/K16乙酰化）丰度约为未甲基化形式的两倍，对应细胞周期S/G2期。
- **簇2**：H4K20me2（伴K12/K16乙酰化）丰度约为未甲基化形式的三倍，反映细胞周期后期染色质成熟。
- **簇3**：H3K4乙酰化与K9/K27/K36/K79单甲基化组合（如H3K4acK9me1），指示转录活跃的早期分化。
- **簇0**：H3K4acK9ac与K79/K27/K36二甲基化组合（如H3K4acK9acK79me2），反映持续转录活跃的终末分化。
- **簇1**：H3K4me3与K9/K27/K36/K79单甲基化组合（如H3K4me3K9me1），对应活跃兼预备染色质。
- **簇7**：H3.1K4ac与K9/K27/K79二甲基化（如H3.1K4acK9me2），表示可及但转录受抑状态。
- **簇4**：高表达HMG-17（HMGN2）、乙酰化H2A/H2B变体、H2A.Z及SmD2，支持祖细胞染色质开放状态。
- **簇8/11**：富集HMGN3，提示核亚群染色质组织异质性。
H3K27和H3K36甲基化呈现多样化组合而非单一构型，证实了已知的拮抗互作。
**批量组蛋白PTM谱与单细胞核蛋白质形特征的比较**
Tier 3 MRM LC-MS/MS分析定量DF与UD核组蛋白肽段，结果显示DF核显著富集H4K20me2（log2FC = -6.24）、H3K27me2（log2FC = -3.70）、H3K79me2（log2FC = -3.77）及H3K14ac（log2FC = -2.97），而UD核富集H4K20me1（log2FC = 7.94）、H3K9me2（log2FC = 5.3）和H3K36me2（log2FC = 1.61），与snPiMS趋势一致，支持细胞周期偶联的组蛋白修饰在分化中的变化。
**讨论与结论**
snPiMS作为新平台，通过整合>17,000个细胞核的蛋白质形数据，解析了12个染色质状态簇，描绘了从祖细胞到终末分化的连续轨迹。与scRNA-seq不同，蛋白质形测量反映终点分子状态，缺乏内在方向性，但通过组合性组蛋白修饰揭示了细胞周期偶联的分化过程。snPiMS能直接检测单个细胞核内的激活和抑制性修饰，定义染色质可塑性为表皮谱系进展的标志。结论部分翻译如下：
本研究证明snPiMS能够实现蛋白质形分辨的人角质形成细胞分化中组蛋白修饰模式表征，揭示单分子水平的组合修饰，并捕获个体细胞核间的异质性，超越了基因组学或免疫染色的分辨率。通过snPiMS，研究人员实现了约50个细胞核/小时的高通量蛋白质形谱分析，绘制了超过17,000个细胞核的染色质状态异质性图谱。snPiMS揭示了单个细胞核内携带激活和抑制修饰的蛋白质形，将染色质可塑性定义为表皮谱系进展的标志。由此产生的蛋白质形定义簇描绘了一个细胞周期偶联的分化连续谱，其中增殖性S/G2-M期祖细胞从乙酰化主导、转录活跃状态过渡到甲基化富集、抑制性构型，代表终末分化。组蛋白H4K20me1的渐进性甲基化被发现并验证在更增殖的UD状态中升高。总之，这些数据将角质形成细胞分化定位为连续的、蛋白质形介导的染色质轨迹，而非离散开关。本研究推进了单细胞核蛋白质组学的新可扩展平台，并为未来细胞分型、染色质失调和单细胞生物学研究奠定了基础。
