《Signal Transduction and Targeted Therapy》：A microbiome meta-transcriptomics pipeline identifies a neutrophil elastase inhibitor that protects the colonic epithelial barrier
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炎症性肠病（IBD）是终身性疾病。当前的治疗方法靶向炎症信号，而非改善屏障通透性或修复。肠道微生物组为利用其在健康肠道稳态中的作用提供了令人兴奋的新药发现机会。明确需要识别微生物群中能够保护肠屏障的生物活性分子。研究人员开发了一个系统性管道，利用宏转录组学数据
炎症性肠病（IBD）是终身性疾病。当前的治疗方法靶向炎症信号，而非改善屏障通透性或修复。肠道微生物组为利用其在健康肠道稳态中的作用提供了令人兴奋的新药发现机会。明确需要识别微生物群中能够保护肠屏障的生物活性分子。研究人员开发了一个系统性管道，利用宏转录组学数据识别、生产、纯化并测试IBD中的微生物蛋白，精确定位了多个与疾病活动相关的新型微生物组衍生蛋白。研究人员识别出一种新的微生物蛋白（BMG-1），它特异性抑制人中性粒细胞弹性蛋白酶（HNE），一种IBD中的致病性蛋白酶。这种蛋白酶抑制作用能够保护肠上皮屏障免受通透性损伤，并促进上皮愈合。BMG-1还能减少小鼠结肠炎模型中的结肠损伤。最后，研究人员显示，天然BMG-1蛋白不仅存在于人类粪便中，而且在IBD高活动性患者中显著减少。这些发现表明，肠道微生物组能够特异性调节结肠中蛋白酶/抗蛋白酶活性的平衡，这代表了IBD的一种新型治疗策略。
**研究背景与问题**
炎症性肠病（IBD）包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD），影响全球超过700万人，是一种终身性疾病，其特征为肠屏障反复受损、通透性增加、微生物易位、过度炎症及黏膜愈合不良。现有生物制剂主要靶向炎症信号，但高达50%的患者初始无应答或12个月内失去应答，导致手术干预延迟而非预防。IBD中上皮屏障功能受损（“渗漏”）和黏膜愈合障碍是疾病病程的预测指标，但未被现有疗法靶向。中性粒细胞大量黏膜浸润是IBD病理特征，其不受控的蛋白酶活性导致隐窝损伤和脓肿形成。肠道微生物组失调与IBD密切相关，但既往研究多集中于代谢物，对微生物分泌蛋白的功能探索不足。因此，开发通过抑制蛋白酶保护肠屏障的新疗法是IBD治疗中未充分探索的创新方向。研究人员利用宏转录组学数据构建系统性管道，旨在识别与IBD诊断和疾病活动相关的微生物基因/蛋白，并筛选具有保护结肠上皮屏障功能的候选分子。
**研究内容与意义**
研究人员开发了一个由宏转录组学分析、蛋白生产纯化、功能测试组成的系统性管道，从人类微生物组计划2（HMP2）IBD子研究（103名参与者：49例CD、28例UC、27例非IBD）的粪便样本中识别出差异表达的微生物基因，并通过分泌预测和实验室可操作性筛选出10个候选基因。功能筛选发现微生物蛋白BMG-1能显著保护人结肠类器官上皮屏障免受中性粒细胞裂解物的损伤。BMG-1基因表达与疾病活动性呈负相关，且其蛋白在IBD高活动性患者粪便中显著降低。BMG-1特异性抑制人中性粒细胞弹性蛋白酶（HNE）和胰弹性蛋白酶，但非组织蛋白酶G或蛋白酶3；其反应中心环（RCL）区域对HNE抑制至关重要。BMG-1促进结肠上皮伤口愈合、防止HNE诱导的细胞死亡，并降低紧密连接基因（ZO-1、OCLDN）的转录上调。在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中，直肠内给予BMG-1减少了结肠损伤和粪便蛋白酶活性。该研究首次证明肠道微生物组可通过特异性蛋白抑制宿主蛋白酶，维持蛋白酶/抗蛋白酶平衡，为IBD提供新的治疗策略。论文发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》。
**关键技术与方法**
主要技术方法包括：1）从HMP2 IBD子研究（103名参与者）获取配对宏基因组和宏转录组数据，构建个性化基因组参考（PGR）；2）使用Prokka进行开放阅读框（ORF）识别，并按98%和100%氨基酸同源性进行基因聚类；3）采用DESeq2和Variance Partition两种统计模型进行差异表达（DE）分析（CD vs 非IBD、UC vs 非IBD、低 vs 高疾病活动性），以粪便钙卫蛋白（200 μg/g）界定活动性；4）通过SignalP和EffectiveDB预测分泌信号肽，筛选候选基因；5）在大肠杆菌中表达候选蛋白，经IMAC纯化并去除内毒素；6）利用人结肠类器官（非IBD和UC患者来源）建立气液界面（ALI）培养的上皮屏障通透性、伤口愈合和细胞死亡测定；7）细胞游离蛋白酶活性测定（使用广谱和弹性蛋白酶特异性荧光底物）；8）液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定人粪便中天然BMG-1蛋白；9）C57BL/6小鼠DSS结肠炎模型（2% DSS饮水6天，直肠内给予BMG-1 10 mg/kg每2天）。
**研究结果**
**系统性肠道微生物组转录组分析识别与UC、CD诊断及疾病活动性相关的微生物基因**
研究人员通过宏转录组分析，鉴定出大量与IBD诊断和疾病活动性相关的差异表达微生物基因。在CD vs 非IBD、UC vs 非IBD、低 vs 高疾病活动性比较中，分别获得797、182和1431个共有差异表达基因，其中超过一半功能未知。随机森林分类器显示，微生物基因表达水平可高精度预测IBD诊断和疾病活动性（AUC值0.83-0.99）。
**功能筛选顶级候选基因将BMG-1鉴定为具有结肠上皮保护作用的微生物蛋白**
在10个候选蛋白中，BMG-1（P3）在人结肠类器官气液界面培养中表现出剂量依赖性的上皮屏障保护作用，能显著降低中性粒细胞裂解物诱导的通透性增加。BMG-1基因表达在IBD低活动性样本中显著上调（约20倍），在高活动性样本中降低，并与粪便钙卫蛋白呈负相关（Spearman r = -0.35, P < 0.0001）。BMG-1基因表达与其预测来源菌种Flavonifractor plautii丰度强相关（Spearman r = 0.77, P = 0.0001）。
**BMG-1是一种强效中性粒细胞蛋白酶抑制剂**
BMG-1（HisBMG-1及无标签BMG-1）在6小时时间窗内剂量依赖性地保护结肠上皮屏障，效果与已知黏膜蛋白酶抑制剂Elafin相当。细胞游离蛋白酶测定显示，BMG-1显著抑制中性粒细胞裂解物和刺激后中性粒细胞上清液的蛋白酶活性。同源蛋白BMG-2（13个氨基酸差异）完全丧失抑制活性。序列比对和AlphaFold 3建模揭示BMG-1具有典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin）样结构，包含一个反应中心环（RCL）区域。对RCL区域进行短乱（scrambled）突变（HisBMG-1Scr）后，蛋白丧失蛋白酶抑制活性和屏障保护功能，表明RCL是BMG-1功能的关键结构域。
**BMG-1特异性抑制人中性粒细胞弹性蛋白酶和胰弹性蛋白酶**
BMG-1（HisBMG-1）在细胞游离测定中强烈且特异性抑制HNE，而对组织蛋白酶G（CatG）无抑制，对蛋白酶3（PR3）仅有微弱抑制（BMG-2和Scr对照在高剂量下抑制PR3）。BMG-1也抑制猪胰弹性蛋白酶（与人类CELA2A有90%同源性），但此抑制不依赖RCL区域（Scr对照同样有效）。质谱分析显示，BMG-1与HNE相互作用后产生切割产物，而Scr对照的切割显著减少，表明BMG-1与HNE结合亲和力更高。在HNE诱导的结肠上皮屏障损伤中，BMG-1剂量依赖性地保护屏障，而Scr对照无效；该保护作用在UC患者来源的类器官细胞系中同样得到验证。
**BMG-1促进结肠上皮伤口愈合并防止结肠上皮细胞死亡**
在结肠上皮划痕伤口愈合实验中，HNE（100 nM）显著延迟非IBD细胞愈合（降低>50%），而BMG-1（所有剂量）加速愈合至100%完全闭合，效果略优于Elafin。Scr对照在低剂量下无效，高剂量下部分有效，表明伤口愈合的保护作用不完全依赖RCL。在UC细胞系中BMG-1同样诱导完全伤口修复。在高剂量HNE（250 nM）诱导细胞死亡实验中，BMG-1（2 μM、1 μM、0.5 μM）完全保护细胞免于死亡和汇合度丧失，而Scr对照无效，MTT实验进一步证实BMG-1剂量依赖性地维持细胞活力。
**BMG-1降低结肠上皮细胞中蛋白酶驱动的紧密连接转录上调**
在IBD结肠类器官上皮细胞中，中性粒细胞裂解物刺激显著上调紧密连接基因ZO-1和OCLDN的表达，BMG-1以剂量依赖性方式降低此上调，而Scr对照无效。对CLDN1的表达无显著影响。BMG-1对趋化因子CXCL1和CXCL8的转录上调无显著降低作用。
**BMG-1在体内减少DSS诱导的结肠炎结肠损伤**
在C57BL/6小鼠DSS结肠炎模型中，直肠内给予BMG-1（10 mg/kg）未改变体重变化，但显著降低了粪便蛋白酶活性，增加了正常结肠组织百分比（即减少损伤组织），并改善了结肠长度缩短。组织学评估显示BMG-1处理组结肠黏膜溃疡和隐窝结构破坏减少。
**BMG-1蛋白在人粪便样本中检出，并在高疾病活动性中减少**
通过LC-MS/MS分析非IBD（n=20）和IBD（n=21）患者粪便样本，在37-50 kDa分子量区间成功鉴定出天然BMG-1蛋白（11/20非IBD，15/21 IBD样本）。定量分析显示，IBD低疾病活动性样本中BMG-1蛋白水平显著高于高疾病活动性样本，确认了BMG-1蛋白在人体中的存在及其与疾病活动性的负相关。
**讨论与结论**
讨论部分指出，BMG-1是首个通过宏转录组学基因表达分析获得的微生物组衍生蛋白药物候选分子。研究揭示肠道微生物可通过特异性蛋白抑制宿主蛋白酶（如HNE），参与维持肠道蛋白酶/抗蛋白酶稳态。在IBD中，BMG-1基因和蛋白表达在高疾病活动性状态下降低，可能由于Flavonifractor丰度变化及环境调控，导致蛋白酶抑制不足，加剧组织损伤。BMG-1可能通过保护上皮屏障维持自身黏膜生态位。研究结论：据研究人员所知，BMG-1是首个通过肠道微生物组转录组基因表达分析产生的微生物组衍生蛋白药物候选分子。研究表明，由宿主和微生物因子共同调控的蛋白酶活性平衡可能参与IBD发病机制。数据揭示，BMG-1对HNE的抑制可能是微生物组贡献于肠道蛋白酶/抗蛋白酶稳态平衡的机制之一。BMG-1代表了未来治疗靶向的新型候选分子，具有增强IBD中上皮屏障完整性和修复的潜力。
