哌甲酯对人体血管内皮的影响

《Translational Psychiatry》：Effects of methylphenidate on the human vascular endothelium

　　

哌甲酯（methylphenidate，MPH）是一种广泛用于治疗注意力缺陷多动障碍（attention-deficit/hyperactivity disorder，ADHD）的精神兴奋剂。新兴的流行病学发现提示，MPH治疗会增加心血管事件的风险。然而，由于无法推断因果关系，有必要进一步研究MPH对人体血管内皮功能的潜在影响。研究人员调查了MPH对人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells，HBEC）和人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells，HAEC）在24小时和48小时内的作用，浓度范围包括对应于治疗性血浆水平的浓度。进行了29个内皮功能相关基因的基因表达谱分析。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、蛋白质印迹法（Western blotting）、免疫荧光（immunofluorescence）和荧光激活细胞分选（FACS）评估了蛋白质表达，并使用荧光素-葡聚糖（FITC-dextran）通透性和电阻抗传感（electric cell-substrate impedance sensing，ECIS）实验评估了屏障功能。还分析了来自ADHD儿童（n=87）和成人（n=102）以及匹配对照（分别为n=4和n=44）血浆中具有差异水平的关键内皮标志物。暴露于MPH改变了几种内皮功能相关基因的水平。在所有测试浓度下，MPH增加了血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）和组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）的分泌，而超治疗浓度（50 μM和/或100 μM MPH）降低了Claudin-5的表达并损害了内皮屏障完整性。在临床血浆样本中，接受MPH治疗的儿童显示vWF水平高于未用药儿童，但在成人样本中未观察到这一现象。研究人员的发现表明，急性暴露于治疗性MPH浓度与内皮激活相关，而超治疗浓度（50 μM和/或100 μM）可能进一步损害屏障完整性。这些实验结果可能提示MPH使用对血管健康的潜在影响。需要进一步研究来确认这些发现。

**论文解读：哌甲酯对人体血管内皮的影响**

**研究背景与问题**

哌甲酯（methylphenidate，MPH）是一种广泛用于治疗注意力缺陷多动障碍（attention-deficit/hyperactivity disorder，ADHD）的精神兴奋剂，通过抑制多巴胺和去甲肾上腺素再摄取来改善注意力和行为控制。然而，近年大规模流行病学研究表明，长期使用MPH可能与心血管疾病风险轻度增加相关，特别是高血压和动脉疾病，甚至在25岁以下人群中也观察到这一关联。尽管已有研究报道MPH使用后血压和心率升高，以及短期使用后心血管事件率增加，但因果关系无法从这些观察性研究中推断，且生物学基础尚不明确。血管内皮是调节分子交换、免疫监视和止血的选择性屏障，其功能紊乱是心血管疾病发展的关键早期事件。研究人员先前发现，接受精神兴奋剂（主要为MPH）治疗的ADHD儿童血浆中可溶性ICAM1和VCAM1（与血管炎症相关的内皮黏附分子）水平升高。此外，仅有一项研究报道了MPH对人体血管内皮的作用，发现超治疗浓度（100 μM）的MPH通过Rac-1和NADPH氧化酶（NOX）驱动的氧化应激诱导Cav1磷酸化，增加脑内皮细胞通透性，但缺乏对更全面内皮功能标志物的评估。因此，本研究旨在系统评估MPH对来自脑和外周的人体血管内皮细胞的影响，涵盖多种浓度，包括治疗性血浆浓度，并结合基因表达、蛋白质验证和临床样本分析，以阐明MPH对内皮功能的分子和功能后果。

**主要关键技术方法**

研究人员采用人脑微血管内皮细胞（HBEC）和人主动脉内皮细胞（HAEC）作为细胞模型，暴露于五种MPH浓度（0、10 μg/L、50 μg/L、50 μM、100 μM），代表治疗性峰值血浆浓度和超治疗浓度，处理24或48小时。关键技术包括：使用nCounter分析系统（NanoString Technologies）进行29个内皮功能相关基因的表达谱分析；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞上清和血浆中vWF及tPA的分泌水平；采用蛋白质印迹法（Western blotting）、免疫细胞化学和荧光激活细胞分选（FACS）评估Claudin-5（CLDN5）和PECAM-1的蛋白质表达及膜定位；利用70 kDa FITC-葡聚糖通透性实验和电阻抗传感（ECIS）检测内皮屏障功能。临床血浆样本来自瑞典斯德哥尔摩一家精神科诊所招募的87名ADHD儿童和102名ADHD成人，以及4名对照儿童和44名对照成人，所有参与者均无自闭症、智力障碍、糖尿病等疾病，且未使用抗生素。统计分析采用ANOVA或多变量线性回归模型。

**研究结果**

**1. 哌甲酯对人血管内皮细胞mRNA表达的影响**
在HBEC中，所有三种MPH浓度（10 μg/L、50 μg/L、50 μM）处理24小时后，7个标志物mRNA表达显著改变（FDR校正后P≤0.05，倍数变化≥1.5或≤0.67）。其中，CLDN5（Claudin-5）mRNA表达一致上调（倍数变化1.89-1.95），vWF（血管性血友病因子）mRNA上调，tPA（组织型纤溶酶原激活物）mRNA下调。JAM-A和PECAM-1 mRNA水平在所有浓度下均显著升高，而PAI-1和TGFβ-1 mRNA水平降低。ZO1和OCLN mRNA在部分浓度下升高，SELP mRNA仅在50 μM时升高，且与vWF mRNA呈强正相关。在HAEC中，尽管样本量小（n=3）导致统计显著性难以达到，但所有MPH影响标志物的倍数变化方向和大小与HBEC一致。

**2. 哌甲酯改变人血管内皮细胞和血浆中vWF与tPA的分泌水平**
在HBEC和HAEC中，所有三种MPH浓度处理24小时均显著增加vWF分泌（超过三倍，调整后P<0.007），同时tPA分泌也增加超过两倍（调整后P<0.049），与tPA mRNA下调相反。vWF mRNA与蛋白水平呈中等正相关（R2=0.353，P=0.005），而tPA则无显著相关。在临床血浆样本中，接受MPH治疗的ADHD儿童显示出比未用药儿童显著更高的vWF水平（调整后P=0.028），多变量线性回归分析进一步证实MPH治疗与vWF水平升高独立相关（调整ADHD症状评分、性别和年龄后仍显著）。然而，成人ADHD样本中未观察到MPH与vWF水平的关联，儿童血浆tPA水平在各组间无显著差异。

**3. 超治疗浓度哌甲酯降低人血管内皮细胞中CLDN5蛋白表达**
蛋白质印迹（Western blotting）显示，MPH处理24小时后，HBEC和HAEC中总CLDN5蛋白水平呈浓度依赖性下降，在100 μM时达到统计显著性（HBEC：调整后P=0.016；HAEC：调整后P=0.046）。免疫细胞化学定量进一步证实，在50 μM和100 μM超治疗浓度下，总CLDN5荧光强度显著降低（调整后P<0.021）。FACS分析使用靶向CLDN5胞外结构域的抗体，显示超治疗浓度MPH显著减少了膜定位的CLDN5蛋白（调整后P<0.048）。48小时处理结果与24小时一致，而PECAM-1蛋白表达在MPH处理后无显著变化。

**4. 超治疗浓度哌甲酯损害人血管内皮细胞屏障功能**
通透性实验表明，100 μM MPH处理24小时显著增加了70 kDa FITC-葡聚糖跨HBEC单层的通量（调整后P=0.0016）。ECIS实时监测显示，10 μg/L和50 μg/L MPH对电阻抗影响极小，而50 μM和/或100 μM MPH显著降低了HBEC和HAEC的电阻抗，表明屏障功能受损（HBEC：调整后P=0.0047；HAEC：调整后P<0.015）。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究首次通过整合转录组分析、蛋白质定量与定位、屏障功能实验以及临床血浆标志物检测，系统评估了MPH对两种初级人血管内皮细胞（脑和主动脉）的影响。主要发现：即使在治疗性血浆浓度下，MPH也能改变内皮激活标志物（vWF和tPA）的表达和分泌，而超治疗浓度（≥50 μM）则进一步降低CLDN5蛋白表达并损害内皮屏障完整性。vWF的升高在儿童ADHD患者血浆中得到验证，可能与MPH诱导的内皮激活或炎症激活有关，但不直接与sICAM-1和sVCAM-1线性相关。tPA的分泌增加可能源于储存囊泡的快速释放，而转录则被抑制。CLDN5的mRNA上调与蛋白减少可能反映了蛋白耗竭后的代偿性转录增加，但超治疗浓度导致CLDN5膜定位减少和屏障破坏。研究局限性包括：体外静态暴露无法模拟体内药代动力学，急性暴露设计无法反映慢性效应，单供体来源的细胞限制了个体变异评估，儿童对照样本量小，以及缺乏血压和心血管病史数据。结论部分总结：MPH暴露与内皮激活相关，超治疗浓度进一步损害脑和外周血管内皮细胞的屏障完整性。这些发现为流行病学报告中MPH相关的潜在心血管风险提供了实验依据，尤其对于长期接受MPH治疗的个体，强调了需要进一步体内研究和纵向临床研究来评估MPH治疗的长期血管效应及其临床相关性。