银纳米颗粒对藏红花（Crocus sativus L.）不同组织及分化条件下与次生代谢物相关的基因表达的诱导效应

《Scientific Reports》：Elicitor effects of silver nanoparticles (AgNPs) on secondary metabolite–related gene expression in different tissues and differentiation conditions of saffron (Crocus sativus L.)

　　

摘要

藏红花（Crocus sativus L.）因其含有的环烯醚萜类化合物，如藏红素、苦藏红素、鳄鱼胆素和藏红花醛，而成为最具价值的药用及芳香植物之一。然而，由于花柱资源有限且该物种难以繁殖，导致这些生物活性化合物的大规模生产受到限制。本研究旨在优化不同藏红花外植体的离体愈伤组织诱导与再生过程，确定建立细胞悬浮培养及分化组织的适宜培养条件，同时评估银纳米粒子作为纳米诱导剂在不同组织分化状态下对类胡萝卜素/环烯醚萜生物合成基因表达及代谢物积累的影响。研究将球茎、小球茎、子房和叶片外植体置于含有16种生长素-细胞分裂素组合的Murashige和Skoog（MS）培养基上，在持续黑暗或16小时光照/8小时黑暗的光周期条件下进行愈伤组织诱导。再生实验则采用6种球茎再生培养基和3种子房再生培养基，以培育小球茎以及直接和间接的花柱状结构。在建立悬浮培养后，分别施加浓度为0、55和110毫克/升的银纳米粒子，处理时间分别为24小时和72小时。通过qRT-PCR技术检测CsPDS、CsLYC、CsBCH、CsZCD和CsUGT2基因的相对表达水平，而藏红素、苦藏红素、鳄鱼胆素和藏红花醛则通过HPLC-DAD技术进行定量分析。在具有响应性的外植体中，那些在持续黑暗条件下、使用含2毫克/升2,4-D和1毫克/升BAP的T2B1培养基培养的小球茎衍生组织，表现出最高的愈伤组织诱导率（69.28%），新鲜重量（590.89毫克），表面积（457.44平方毫米），且愈伤组织质量优异，能够形成适合悬浮培养的大型松散愈伤组织。在再生方面，COEX4培养基（含0.1毫克/升NAA和2.0毫克/升BAP）能带来最高的再生频率（75.20%），小球茎新鲜重量为1.38克，直径为9.72毫米。子房外植体可培育出直接和间接的花柱状结构，其中ROVR2培养基（含5毫克/升NAA和5毫克/升BAP）能产生最多的间接花柱状结构，每株外植体可形成23.5个；而ROVR3培养基（含10毫克/升NAA和10毫克/升BAP）则能产生最多的直接花柱状结构，每株外植体可形成6.6个。在未分化的悬浮培养细胞中未检测到目标基因的表达，这说明仅靠银纳米粒子诱导并不足以在没有组织分化的情况下激活类胡萝卜素和环烯醚萜的生物合成途径。相比之下，已分化的组织则表现出明显的剂量和时间依赖性转录反应，其中在用110毫克/升银纳米粒子处理72小时后，诱导效果最为显著。直接花柱状结构中CsPDS、CsLYC和CsBCH基因的诱导程度最高，而温室培育的花柱则表现出CsZCD和CsUGT2基因的最高表达水平。HPLC-DAD分析证实，银纳米粒子诱导后，藏红素、苦藏红素、鳄鱼胆素和藏红花醛的含量均有所增加，其中藏红素是主要的代谢物。在110毫克/升银纳米粒子处理72小时后，代谢物积累程度最高，其中温室培育的花柱所含浓度最高，其次是直接花柱状结构和间接花柱状结构。本研究表明，成功优化组织培养与再生工艺是实现藏红花高效纳米诱导的关键前提。银纳米粒子仅能在已分化的组织中增强类胡萝卜素/环烯醚萜生物合成基因的表达及代谢物积累，这表明组织分化对于代谢活性的激活至关重要。将优化后的再生方案与银纳米粒子诱导技术相结合，可为提高高价值藏红花环烯醚萜的离体生产水平提供有效途径，同时也为藏红花生物技术和代谢工程领域的未来发展奠定基础。