《Scientific Reports》：Determination of the most suitable reference gene for transcription analysis of synovial tissue from osteoarthritis patients
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滑膜组织在骨关节炎（osteoarthritis, OA）发病机制中发挥关键作用。基因表达分析被广泛用于探究潜在病理机制；然而，靶标mRNA表达的准确归一化依赖于稳定参考基因的使用。本研究评估了常用参考基因在确定滑膜组织mRNA表达方面的适用性，并考虑了多种影
滑膜组织在骨关节炎（osteoarthritis, OA）发病机制中发挥关键作用。基因表达分析被广泛用于探究潜在病理机制；然而，靶标mRNA表达的准确归一化依赖于稳定参考基因的使用。本研究评估了常用参考基因在确定滑膜组织mRNA表达方面的适用性，并考虑了多种影响因素。在20例终末期OA患者的滑膜组织中，研究人员采用四种不同分析方法（NormFinder、geNorm、ΔCt法及Pearson相关分析）评估了10个参考基因（GAPDH、RPLP0、YWHAZ、TBP、PPIA、EEF1A1、ACTB、HPRT1、SDHA及RPL13A）的表达稳定性，并通过后续排序分析确定最稳定基因。研究同时考虑了整体样本池及各亚组（性别、年龄、体重指数（body mass index, BMI）及滑膜炎评分）。结果显示，RPL13A、PPIA及EEF1A1被确定为整体上最稳定的参考基因，各亚组间变异性较小；相反，GAPDH被证实为最不适合的参考基因，表现出最大的表达变异性。参考基因的稳定性可能受性别、年龄及BMI影响，应在研究中予以考虑。
该研究围绕骨关节炎（osteoarthritis, OA）滑膜组织基因表达分析中参考基因选择这一核心问题展开。目前，针对OA患者滑膜组织可靠的非调节性参考基因尚无明确信息，而年龄、性别、肥胖等OA危险因素可通过衰老、炎症介质和激素影响典型参考基因的表达，既往研究在选择稳定参考基因时很少考虑这些因素对表达的影响，且局部炎症过程和全身炎症也可能影响滑细胞内生化过程及参考基因表达，不合适的参考基因会导致RT?qPCR结果误判，因此亟需验证适用于OA患者滑膜组织的特异性参考基因。
研究人员以20例终末期OA膝关节置换术患者的滑膜组织为样本，检测10个候选参考基因（GAPDH、RPLP0、YWHAZ、TBP、PPIA、EEF1A1、ACTB、HPRT1、SDHA、RPL13A）的表达，采用NormFinder、geNorm、ΔCt法、Pearson相关分析四种算法评估稳定性并排序，同时按性别、年龄、BMI、滑膜炎评分分层亚组分析，并以靶基因MMP1、MMP3验证不同参考基因归一化对结果的影响，最终确定最适参考基因并明确亚组差异。论文发表于《Scientific Reports》。
作者开展研究用到的主要关键技术方法包括：获取20例终末期OA患者（9女11男，平均年龄66.7岁±7.0 SD，平均BMI 32.2±4.5）膝关节置换术的滑膜组织样本，按性别、年龄（≤61岁与≥70岁）、BMI（<30与>30）、滑膜炎评分（2?3与4?5）分为亚组；提取总RNA并合成cDNA；设计人特异性引物进行定量PCR（qPCR）；采用NormFinder、geNorm、ΔCt法、Pearson相关分析四种算法计算参考基因稳定性值（S值、M值、平均标准差、倒置决定系数）并排序；以效率校正的ΔΔCt法计算靶基因MMP1、MMP3归一化表达量，用Mann?Whitney U检验进行统计差异分析。
Expression levels of reference genes：研究人员分析10个候选参考基因的Ct值，发现平均Ct值范围为18.07（EEF1A1）至26.15（TBP），高表达基因为EEF1A1（Ct=18.07±0.91）、RPL13A（Ct=18.70±0.80）、RPLP0（Ct=18.83±0.87）、ACTB（Ct=18.91±0.92），低表达为TBP（Ct=26.15±0.74）、HPRT1（Ct=25.63±0.99），其余基因Ct值介于20?25；按年龄、性别、BMI、滑膜炎评分分亚组后，各亚组间Ct值无显著差异。
Expression stability and validation of reference genes of the total sample set：研究人员通过四种算法分析整体样本集稳定性，NormFinder显示RPL13A（S=0.187）、PPIA（S=0.192）最稳定，TBP（S=0.371）、GAPDH（S=0.527）最不稳定；geNorm显示RPLP0与RPL13A（均M=0.182）最稳定；Pearson相关分析显示EEF1A1倒置决定系数最接近0（对应决定系数0.946，p<0.001）最稳定；ΔCt法显示PPIA平均标准差最小（0.07）、GAPDH最大（0.57）；综合排序RPL13A、PPIA、EEF1A1为最稳定基因（RPL13A排名1?3），GAPDH、TBP、ACTB为最不稳定（GAPDH排名10，TBP排名9）。
Expression stability and validation of reference genes after subgrouping：研究人员按性别、年龄、BMI、滑膜炎评分分层分析，性别亚组中男性RPL13A最稳定、女性PPIA最稳定，GAPDH均最不稳定；年龄亚组中≤61岁与两组合并组HPRT1最稳定，≥70岁组SDHA最稳定，GAPDH均最不稳定；BMI亚组中BMI>30组与两组合并组PPIA最稳定，BMI<30组ACTB最稳定，GAPDH均最不稳定；滑膜炎评分亚组中总分与2?3分组RPL13A最稳定，4?5分组EEF1A1最稳定，高分租TBP最不稳定、其余GAPDH最不稳定；综上RPL13A在整体及几乎所有亚组均属最稳定，GAPDH在所有亚组均最不稳定（仅一例例外）。
Expression of target genes：研究人员以MMP1（平均Ct=24.07±1.86）与MMP3（平均Ct=22.33±2.98）为靶基因验证，性别分层归一化显示MMP3用GAPDH归一化有显著差异（p=0.044），用RPL13A则无；MMP1无论用GAPDH（女性高1.8倍，p=0.044）或RPL13A（高1.7倍，p=0.037）均显示女性表达显著更高；年龄、BMI、滑膜炎评分亚组均无显著差异；表明不稳定参考基因可致结果误判。
讨论部分总结：研究人员指出参考基因稳定性受疾病、严重程度、合并症及年龄、性别、BMI影响，不合适参考基因会致数据误释；既往滑膜相关研究多用GAPDH、ACTB等，少数系统评估提出HPRT1、RPLP0、EEF1A1，但未考虑人口学参数影响；本研究确认RPL13A、PPIA、EEF1A1为整体最稳定，GAPDH最不稳定，与既往EEF1A1在滑膜成纤维细胞稳定、RPL13A在OA软骨稳定、PPIA在滑源细胞稳定的结论一致；亚组分析显示稳定性随人群特征变化，如年轻者HPRT1、RPL13A、PPIA稳，年老者用SDHA、EEF1A1更优，性别、BMI、炎症亦微调排名但核心三基因仍稳健；靶基因分析显示GAPDH归一化致MMP3性别差异假阳性，RPL13A则无，强调不稳定基因的影响；研究遵循MIQE指南，局限在于仅限OA滑膜、候选基因预选、亚组样本量小、MMP1引物效率120%、部分RNA完整性数值略低，但多方法分析增强稳健性。
研究结论部分翻译：综上，研究人员确定RPL13A、PPIA及EEF1A1为OA患者滑膜组织最稳定的参考基因，GAPDH为最不适合的基因；参考基因的选择被证实对基因表达分析结果有显著影响，尤其在亚组分析中；因此，实验设计中应仔细考虑年龄、性别及BMI等队列特征。
