综述：寻找小妖精：GREM1作为包括青光眼在内的多种疾病的新治疗靶点

《Pharmacological Reviews》：Hunting Gremlins: GREM1 as a New Therapeutic Target for Multiple Diseases Including Glaucoma

　　摘要：转化生长因子β（TGF-β）信号分子超家族在正常发育和生理稳态中起着重要作用。然而，该超家族成员之间的异常信号传导在多种疾病中具有重要的致病作用。多功能细胞因子及生长因子TGF-β的表达增加会导致与多种疾病相关的异常信号传导，包括多组织纤维化、各类癌症、肥胖症和糖尿病、青光眼等。通常情况下，TGF-β的促纤维化作用会通过骨形态发生蛋白（BMPs）的信号传导得到调控。不幸的是，许多疾病状态下BMP拮抗剂Gremlin-1（GREM1）的表达会增加，从而抑制BMPs的这种保护作用。由于TGF-β仍是维持正常组织/细胞功能所必需的基础信号分子，因此将其作为治疗靶点具有挑战性。而GREM1则是一个更具吸引力的治疗靶点，因为它在发育后的大多数组织中的表达较为有限。不过，针对GREM1的研究一直面临很大困难，长期以来被认为是一种“难以用药”的靶点。幸运的是，目前有一些新的研究方法正在被探索，包括开发针对GREM1的适配体、PROTAC小分子、中和抗体，以及设计蛋白-蛋白相互作用抑制剂，这些方法旨在直接靶向并抑制GREM1的致病功能和活性，从而恢复生理稳态。

引言：众多生长因子和细胞因子属于庞大的TGF-β超家族，它们对于参与正常发育、组织稳态以及多种疾病的众多信号传导活动至关重要。该家族的成员包括TGF-β1至TGF-β3、骨形态发生蛋白（BMPs）及相关生长分化因子（GDFs）、胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF），以及激活素/抑制素（ACT/INH）等。这些细胞因子在发育过程中（调节细胞增殖与分化）、生理稳态状态下（促进细胞存活、细胞外基质重塑及伤口愈合），以及疾病状态下（如纤维化、癌症和代谢紊乱）都会影响多种细胞和组织。它们的作用具有很强的环境依赖性，会因周围微环境、目标细胞类型以及发育或病理过程的阶段而有所不同。本综述重点探讨TGF-β和BMP信号通路，同时研究BMP拮抗剂Gremlin-1（GREM1）如何调控这些通路的生物学和病理学功能，从而为药物干预提供新的靶点。TGF-β和BMP对于胚胎发育以及维持成人组织中的干细胞微环境至关重要。TGF-β们可调节干细胞的命运决定、增殖、分化、迁移、存活、血管生成以及上皮-间质转化过程。而BMPs则能形成形态发生梯度，调控骨骼（骨和软骨）的发育、晶状体的形成、脂肪生成、细胞生长与分化以及细胞凋亡，同时通常会抑制上皮-间质转化。这些通路的作用在很大程度上取决于具体环境、时间、发育阶段以及细胞类型。

TGF-β超家族的成员，包括TGF-β亚家族和BMP亚家族，都具有保守的结构特征，由N端的信号肽、前结构域（潜伏相关片段）、一个能被丝氨酸蛋白酶如furin识别的内含二碱基RXXR蛋白水解位点，以及一个富含半胱氨酸的C端生长因子结构域组成，后者会形成半胱氨酸结结构。经过蛋白水解处理并通过链间二硫键形成二聚体后，这个C端片段便成为具有生物活性的配体，能够与受体结合并引发下游信号传导。人类共有三种主要的TGF-β异构体——TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3——它们都以含有潜伏相关肽段（LAP）结构域的pro肽二硫键连接二聚体形式分泌，该LAP结构域与非共价地结合在潜伏型TGF-β结合蛋白上。这个大型复合物会被定向输送到细胞外基质中并储存在其中。要激活潜伏型的TGF-β，就需要金属蛋白酶BMP1对LTBP进行蛋白水解切割，尽管BMP1的名字中带有“BMP”，但它并非典型的BMP配体，这一切割作用可使TGF-β二聚体部分释放出来。随后，LAP结构域会被furin或基质金属蛋白酶进一步切割，或者通过整合素介导的机械激活，最终释放出成熟的半胱氨酸结结构生长因子二聚体，该二聚体可与TGF-β受体结合并启动信号传导过程。人类存在多种TGF-β受体基因，包括7种I型受体和5种II型受体。信号受体复合物由两对TGF-βR1和TGF-βR2同源二聚体组成，通常的排列方式为(TGF-βR1)2(TGF-βR2)2。TGF-βR1和TGF-βR2都属于双特异性激酶，能够磷酸化丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基；当配体与受体结合后，TGF-βR2会通过自磷酸化被激活，进而磷酸化TGF-βR1。被激活的TGF-βR1会进一步磷酸化特定的细胞质蛋白，从而推动细胞内的信号级联反应持续进行。共受体既可以促进也可以干扰TGF-βR复合物的形成。被激活的受体会迅速被转运到内体或洞窝中，从而让信号传导能够根据周围环境发生动态变化。TGFβ信号传导存在两条主要的下游分支。第一条是经典的SMAD信号通路。“SMAD”这一名称是由“SMA相关蛋白”和“MAD相关蛋白”组合而来的，反映了这些蛋白最初的发现背景。SMA相关蛋白源自秀丽隐杆线虫的sma基因，该基因编码的蛋白可通过类似TGFβ的信号通路调控生物体大小；而MAD相关蛋白则来自果蝇的Mothers Against Decapentaplegic基因，它最初是被发现是果蝇BMP信号通路中的关键成分。经典的TGF-β SMAD信号通路涉及SMAD2、SMAD3以及共同的中介分子SMAD4。被激活的TGF-βR1会磷酸化SMAD2，随后SMAD2会与SMAD4结合；这个复合物会转移到细胞核中，与SMAD3结合并调控依赖于SMAD的基因转录。与之相反，非SMAD信号通路则会激活其他信号通路，包括p38、JNK和ERK1/2等MAP激酶通路，以及AKT、Rho/ROCK和NFκB等其他通路。细胞膜的环境会影响哪种TGF-β信号通路会被激活。与网格蛋白相关的TGF-β受体更倾向于促进SMAD信号传导，而与洞窝蛋白相关的TGF-β受体则更有利于非SMAD信号传导。TGF-β信号传导还会受到内源性信号抑制因子的调控。SMAD7通过与被激活的TGFBRI结合，阻止SMAD2/3的磷酸化，并招募E3泛素连接酶SMURF1/2，这些酶会促进受体和Smad蛋白的降解。而假受体BAMBI和免疫亲和素FKBP12则会直接与TGF-β受体相互作用来抑制信号传导，其中BAMBI会形成无功能的受体复合物，FKBP12则会使TGFBRI保持非活性构象。BMP信号通路的整体结构和作用机制与TGF-β信号通路极为相似。人类基因组中编码有12种BMP配体，它们都与TGF-β配体具有显著的结构相似性。BMP1并非典型的BMP配体，而是一种分泌型的金属蛋白酶，它参与对TGF-β和BMP前体蛋白的蛋白水解激活作用。人类有4种I型BMP受体（ALK1、ALK2、ALK3、ALK6）和3种II型BMP受体（BMPR2、ACVR2A、ACVR2B）。受体信号传导复合物通常由两个BMPR1亚单位和两个BMPR2亚单位组成，I型和II型受体在这两种亚单位的组合上存在差异。BMP信号传导也通过两条主要的下游通路进行。经典的SMAD通路涉及受体调控的SMAD蛋白（SMAD1/-5/-8），这些蛋白会被激活的BMPR复合物磷酸化。在人类中，SMAD9（曾被称为SMAD8）编码的正是那种在经典BMP信号传导中与SMAD1和SMAD5协同作用的、由BMP激活的受体调控型SMAD蛋白。这些被磷酸化的SMAD蛋白会与共同的中介分子SMAD4结合，然后转移至细胞核中，调控目标基因的转录表达。非SMAD信号通路则涉及BMPR介导的ERK、JNK、p38 MAPK的激活，以及Cdc42这样的小GTP酶和PI3K/AKT通路的激活，这些信号级联反应同样可以调控基因表达。BMP信号传导会受到细胞内外多种拮抗因子的严格调控。具有抑制作用的SMAD6以及SMURF1/2复合物会抑制受体调控的SMAD蛋白的激活并促进其降解，而BAMBI则作为一种假受体，能够抑制有效的BMPR复合物的形成。Chordin、Noggin、Follistatin和Gremlin-1则会在细胞外与BMP配体结合，阻止它们与BMPR复合物结合。鉴于TGF-β和BMP信号通路在结构和机制上的高度相似性——包括都使用共同的中介分子SMAD4，以及存在重叠的非SMAD效应信号级联通路——这两种通路之间常常会出现信号交互作用。在很多情况下，BMPs会调节甚至抑制TGF-β信号传导。例如，BMP-4和BMP-7就能抑制TGF-β信号传导的促纤维化作用，这一作用在眼部也会出现。Gremlin-1（GREM1）会通过直接与BMP配体结合来抑制BMP信号传导，从而阻止这些配体与BMPR复合物结合并被激活。GREM1是一种由184个氨基酸组成的21 kD分泌蛋白，它属于TGF-β超家族以及Cerberus/DAN家族的半胱氨酸结结构蛋白。GREM1上存在糖基化位点和可能的磷酸化位点，它可以通过与肝素和肝素硫酸盐结合而定位于细胞外基质中。GREM1以同二聚体形式存在，其结合模式为头对尾朝向，它主要与BMP-2、BMP-4和BMP-7结合并发挥拮抗作用，其结合比例大概为1个GREM1二聚体对应1个BMP二聚体（不过第XI节后面会讨论可能存在非1:1的比例情况）。最新研究表明，与细胞膜上的肝素硫酸盐结合的、被GREM1结合的BMP2复合物，可以通过网格蛋白介导的内吞作用和洞窝蛋白介导的内吞作用两种途径被细胞摄取，之后GREM1又会从早期内体中释放出来并再次被分泌到细胞外。这表明除了直接阻止BMP2与其受体复合物结合之外，GREM1还可能以催化方式降解BMP2。在发育过程中，GREM1会在多种组织中表达，有助于维持干细胞微环境。在成人组织中，GREM1的表达在很大程度上取决于具体的组织类型和细胞类型，在某些特定的成人干细胞微环境中，它具有重要的生理稳态调控作用，而异常的、异位的或过量的GREM1表达则会导致多种病理过程的发生。表1总结了GREM1的主要结构特征和功能特点。另有研究显示，GREM1还具有非典型的、与BMP无关的作用。GREM1是一种VEGFR2激动剂，具有纳摩尔级的结合亲和力，要达到这种亲和力，就必须与肝素或肝素硫酸盐结合，这种结合会形成VEGFR2/αvβ3/HSPG复合物，而且这种结合并不依赖于BMP信号通路。GREM1与VEGFR2结合后会诱导后者磷酸化，进而促进细胞的增殖、迁移和血管生成，这种信号传导还会通过产生各种细胞因子和黏附分子来引发内皮细胞的炎症反应，而这些炎症因子又会促使单核细胞和淋巴细胞侵入组织。GREM1-VEGFR2信号传导与Ang1/Tie2信号通路的激活有关，在骨关节炎、糖尿病视网膜病变和癌症等多种疾病中都具有促血管生成的作用。除了能够与VEGFR2结合并激活它之外，还有研究显示GREM1能够与FGFR1结合；在乳腺癌模型中，也观察到了GREM1驱动EGFR依赖性信号通路的激活现象。目前尚未有研究报道GREM1能够直接与EGFR结合。相反，也有研究者未能在培养的内皮细胞中证实GREM1能够介导VEGFR2信号传导。

片段摘录：
1. **GREM1在发育和生理稳态中的信号作用**：TGF-β超家族成员之间的复杂相互作用在发育和生理稳态过程中起着至关重要的作用。BMPs及其拮抗剂都是参与肺、四肢和大脑胚胎发育以及形态发生的基因，它们能够形成形态发生梯度并引发不同信号通路之间的交互作用。在四肢形态形成过程中，GREM1并非通过直接结合，而是通过信号通路间的交互作用间接调控Hedgehog信号通路。
2. **GREM1在癌症中的作用**：GREM1的表达与多种类型的癌症相关。不过，骨形态发生蛋白信号通路在癌症中的作用十分复杂，它会根据癌症的类型、发展阶段以及特定的肿瘤微环境，要么起到促进肿瘤生长的作用，要么起到抑制肿瘤的作用。作为BMP信号通路的关键拮抗剂，GREM1通常与肿瘤的起始和发展密切相关，在肿瘤微环境中，它的表达往往会上升，而那里存在与癌症相关的成纤维细胞。
3. **GREM1在原发性纤维化疾病中的作用**：TGFβ1、TGFβ2和/或GREM1水平持续升高会营造出促纤维化的环境，这与多种病理性的纤维化疾病有关。在原发性纤维化疾病中，GREM1表达水平的上升似乎反映了发育过程中伤口愈合程序的重新激活，但不同组织中调控这一过程的机制存在差异。在肝纤维化中，GREM1会进一步加强与TGFβ相关的肝星状细胞的活化作用，而miR-23b/27b基因簇则会起到抑制作用。
4. **骨关节炎**：骨关节炎是一种较为常见且疼痛程度较高的疾病，其发病原因是关节软骨发生了不可逆的炎症损伤。目前看来GREM1与骨关节炎存在关联，不过它的具体作用机制仍存在争议。GREM1能够调控骨骼中的成软骨细胞和成骨细胞，而在小鼠中敲除Grem1基因会导致骨关节炎的发生。此外，关节软骨祖细胞中Grem1表达水平的下降也与骨关节炎的发生有关，这说明GREM1对于维持正常的骨骼结构是必要的。
5. **心血管疾病**：在心血管疾病中，GREM1似乎具有双重作用。GREM1能够提高心脏间充质祖细胞的存活率，并使老化的人类心脏间充质细胞恢复活力，这表明GREM1可能对缺血性心脏病具有治疗作用。在ST段抬高型急性心肌梗死期间发生的室颤是导致猝死的重要原因。虽然遗传因素与室颤有关，但拷贝数变异的贡献则相对较小。

越来越多的证据表明GREM1与精神神经发育障碍有关。例如，精神分裂症是一种由复杂遗传和环境因素引起的慢性疾病，患者会出现多种认知症状，从而影响其日常功能和社会交往能力。通过对45,000多个来自精神分裂症患者的脑组织细胞进行单细胞RNA测序，发现这些细胞中的Grem1表达水平显著升高。

在多种组织的炎症反应中，GREM1也发挥着重要作用。其作用因具体情境而异，有时会促进炎症，有时则会抑制炎症。GREM1能以纳摩尔级的亲和力结合并隔离巨噬细胞迁移抑制因子。该因子在动脉粥样硬化斑块的形成及动脉粥样硬化的进展过程中起着关键作用。ApoE-/-小鼠可作为动脉粥样硬化的临床前模型，对这些小鼠进行治疗可……

GREM1与多种以纤维化和病理性血管生成为特征的视网膜病变有关。在糖尿病性增殖性视网膜病变和增殖性玻璃体视网膜病变等病症中，GREM1的水平会升高。增殖性玻璃体视网膜病变是指视网膜脱离后出现的过度瘢痕形成反应，涉及视网膜色素上皮细胞、穆勒细胞等胶质细胞以及炎性细胞的增殖。GREM1由穆勒细胞分泌，它在……

在青光眼这一导致不可逆视力丧失和失明的主要疾病中（见表4），全球有7000万至8000万人受到影响，到2040年这一数字还将上升至1.12亿，到2060年则可达1.85亿。这种隐匿性疾病实际上是一组进行性视神经病变，其临床特征为视神经头凹陷以及视野逐渐丧失。视力丧失是由于视网膜内无髓鞘的视网膜神经节细胞轴突首先受到损伤所致。

鉴于GREM1在癌症和纤维化中的作用，不难理解为何有诸多治疗策略正在针对这一蛋白进行研究。目前一种针对GREM1的治疗策略是开发中和型单克隆抗体。Ginisortamab（UCB6114；下文将详细阐述）在纤维化实验模型中展现了抗纤维化效果。这款单克隆抗体也在用于实体瘤的临床研究（Clinical Trials.gov编号：……）。

**关于基于GREM1的POAG及其他疾病治疗的结论**

总体而言，POAG的治疗正处于关键时刻，目前仅侧重于降低眼压的传统方法需要辅以针对疾病分子机制的干预策略。作为TGF-β和BMP信号通路的中心调控因子，靶向GREM1为治疗提供了有力的途径。通过抑制GREM1，可以减轻其过度的病理活性，进而避免其在结构和功能方面的不良变化。

**CRediT作者贡献说明：**
David P. Siderovski：概念设计、数据整理、正式分析、资金获取、研究实施、方法学设计、项目管理、资源协调、软件应用、监督指导、验证分析、可视化处理、初稿撰写、审稿与编辑；
Nishanth Myneni：数据整理、研究实施、初稿撰写；
Monica Botross：数据整理、研究实施、初稿撰写；
Pinkal D. Patel：数据整理、研究实施、初稿撰写；
Abbot F. Clark：……

**致谢：**
本综述的部分研究工作得到了美国国立卫生研究院/国家眼科研究所R21项目（EY036503）对AFC和DPS的资助。

David P. Siderovski | Nishanth Myneni | Monica Botross | Pinkal D. Patel | Abbot F. Clark
德克萨斯州沃思堡北德克萨斯大学药理学与神经科学系