《Radiation Medicine and Protection》：N-oxalyl-d-phenylalanine ameliorates radiation-induced lung injury by activation of hypoxia inducible factor-mediated pathway
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目的：研究N-草酰基-D-苯丙氨酸（NOFD）对放射性肺损伤（RILI）的辐射防护作用，并确定缺氧诱导因子（HIF）相关调控是否参与其保护作用。方法：雄性C57BL/6小鼠随机分为四组：对照组（未照射+生理盐水）、IR+NS组（照射+生理盐水）、IR+NOFD
目的：研究N-草酰基-D-苯丙氨酸（NOFD）对放射性肺损伤（RILI）的辐射防护作用，并确定缺氧诱导因子（HIF）相关调控是否参与其保护作用。方法：雄性C57BL/6小鼠随机分为四组：对照组（未照射+生理盐水）、IR+NS组（照射+生理盐水）、IR+NOFD组（照射+5 mg/kg NOFD）和IR+Amifostine组（照射+5 mg/kg Amifostine）（n=5）。研究人员在单次15 Gy胸部X射线照射（头和腹部屏蔽）的鼠RILI模型中评估了NOFD的体内辐射防护潜力。每日记录体重，并通过苏木精-伊红（H&E）染色检查组织学损伤。使用相应生化检测试剂盒测量氧化应激标志物，包括丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）。使用ELISA试剂盒评估炎症和促纤维化细胞因子，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和转化生长因子-β1（TGF-β1），以及HIF相关调控因子，包括缺氧诱导因子-1α（HIF1α）、脯氨酰羟化酶域蛋白（PHD）和血管内皮生长因子A（VEGF-A）。为研究HIF相关调控的作用，利用CRISPR-Cas9技术生成了HIF1A和HIF2A缺陷的人支气管上皮BEAS-2B细胞系。通过免疫荧光和流式细胞术评估了照射野生型细胞、NOFD处理野生型细胞和HIF缺陷细胞中的细胞内氧化敏感性荧光、γ-H2AX信号和细胞周期分布。进一步通过定量实时PCR（qPCR）检测了HIF相关及功能相关基因的mRNA表达。结果：在鼠RILI模型中，NOFD有效减轻了照射诱导的体重减轻和肺组织病理学损伤，包括肺泡破坏和炎症浸润。与IR+NS组相比，NOFD处理使SOD和CAT活性分别增加2.11倍和3.42倍，并将MDA水平降低67.60%。NOFD还恢复了照射肺组织中HIF相关调控因子，包括PHD上调2.96倍，这使HIF1α积累减少24.58%，并抑制VEGF-A过表达52.02%。此外，NOFD减弱了炎症和促纤维化细胞因子（TNF-α、IL-1β、TGF-β1）。在照射支气管上皮细胞中，与照射野生型BEAS-2B细胞相比，NOFD预处理使γ-H2AX信号显著降低63.72%，ROS积累减少51.46%。HIF1A缺陷细胞比HIF2A缺陷细胞表现出更高的辐射敏感性，γ-H2AX水平（1.29倍）和ROS水平（2.34倍）相对于照射野生型细胞更高。NOFD降低了照射野生型BEAS-2B细胞中的γ-H2AX信号和细胞内氧化敏感性荧光，而HIF1A或HIF2A缺陷细胞则表现出更高的辐射敏感性和增强的辐射相关G2/M期积累。在基础条件下，NOFD使HO1和P53表达分别增加约1.38倍和2.83倍，同时使BNIP3表达降低约25.42%。结论：NOFD在组织和细胞水平均能减轻辐射诱导的肺损伤。这些发现支持HIF相关调控是NOFD介导的辐射保护所必需的，并提示NOFD可作为缓解RILI的潜在候选药物。
**论文解读文章**
**研究背景与目的**
放射性肺损伤（RILI）是胸部恶性肿瘤放疗中常见的剂量限制性并发症，严重影响疗效和患者生活质量。尽管放疗技术如调强放疗（IMRT）和质子治疗不断进步，但RILI的发生率仍高达5%–40%，死亡率可达15%。RILI通常从急性放射性肺炎（RP）进展为慢性肺纤维化，其病理机制涉及氧化应激、DNA损伤、炎症、凋亡和纤维化的自我维持网络。然而，目前有效且耐受性良好的药物干预措施仍十分有限，尤其是在早期炎症阶段。阿米福汀是唯一获FDA批准的辐射防护剂，但其副作用（如低血压、恶心、呕吐）限制了广泛应用。已有研究表明，缺氧诱导因子（HIF）信号通路在辐射损伤中发挥环境依赖性作用：HIF是调控代谢和维持稳态的转录因子，其活性受脯氨酰羟化酶域蛋白（PHD）和HIF抑制因子（FIH）的内源性抑制。N-草酰基-D-苯丙氨酸（NOFD）是一种特异性FIH抑制剂，可阻断FIH活性并增强HIF转录活性，从而在辐射诱导的肠道和造血损伤中发挥辐射保护作用。基于这些发现，研究人员将研究扩展至肺系统，旨在评估NOFD对RILI的辐射保护效果，并探讨HIF相关调控是否参与其保护作用。
**关键技术方法**
研究人员采用雄性C57BL/6小鼠（购自北京维通利华）建立单次15 Gy胸部X射线照射（头和腹部屏蔽）的RILI模型，评价NOFD（5 mg/kg）的体内辐射保护效果。利用CRISPR-Cas9技术生成HIF1A和HIF2A缺陷的人支气管上皮BEAS-2B细胞系，用于研究HIF相关调控的细胞机制。主要检测指标包括：体重变化、组织学损伤（H&E染色）、氧化应激标志物（MDA、SOD、CAT）、炎症和促纤维化细胞因子（TNF-α、IL-1β、TGF-β1）以及HIF相关调控因子（HIF1α、PHD、VEGF-A）的蛋白水平（ELISA）；细胞内ROS（DCFH-DA荧光探针）、γ-H2AX信号（免疫荧光）和细胞周期分布（流式细胞术）；mRNA表达（qPCR）。
**研究结果**
**3.1 体内辐射保护效果**
在单次15 Gy胸部照射的RILI小鼠模型中，NOFD有效减轻了照射诱导的体重减轻和肺组织病理学损伤（包括肺泡破坏和炎症浸润）。与对照组相比，IR+NS组体重下降最明显，而IR+NOFD组体重无明显下降，且优于阿米福汀组。血清学检测显示，NOFD降低了照射后升高的IL-1β和TNF-α水平（分别降低17.05%和18.72%），并促进造血功能恢复。
**3.2 NOFD减轻氧化损伤并调节HIF相关标志物**
照射后肺组织SOD和CAT活性降低、MDA水平升高，表明氧化损伤增强。NOFD处理使SOD和CAT活性分别增加2.11倍和3.42倍，MDA水平降低67.60%。同时，NOFD显著上调PHD表达2.96倍，进而减少HIF1α积累24.58%，抑制VEGF-A过表达52.02%。此外，NOFD降低了促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和促纤维化因子TGF-β1水平，其中TGF-β1下降幅度尤为明显。
**3.3 NOFD减轻细胞损伤与HIF相关调控**
利用CRISPR-Cas9敲除HIF1A或HIF2A的BEAS-2B细胞，在照射后表现出更高的辐射敏感性：克隆存活率下降，γ-H2AX信号和ROS积累增加（HIF1A缺陷细胞增加更显著），且G2/M期积累增强。NOFD预处理（20 μg/mL）在野生型细胞中显著降低γ-H2AX信号63.72%和ROS积累51.46%，但G2/M期比例与照射野生型细胞相当，表明NOFD的保护作用与HIF相关调控有关。
**3.4 NOFD调节mRNA表达**
在基础条件下，NOFD使HIF1A、HIF2A、VEGFA、HO1和P53的mRNA表达上调（分别增加1.72、1.21、2.37、1.38和2.83倍），同时降低BNIP3表达25.42%。在照射条件下，NOFD进一步上调HO1表达，并抑制照射诱导的BNIP3上调，但未恢复照射后降低的P53表达。这些结果表明NOFD选择性重塑了HIF相关和应激反应基因的转录谱。
**讨论与结论**
NOFD在组织和细胞水平均能减轻RILI，其机制与HIF相关调控密切相关。NOFD作为FIH抑制剂，通过抑制FIH活性增强HIF转录活性，进而触发PHD负反馈上调，形成脉冲式HIF动态，避免过度HIF激活，同时支持细胞存活。NOFD还可通过HIF与NF-κB的交互作用部分减轻炎症反应。在基础条件下，NOFD诱导的P53上调与BNIP3下调的基因选择性模式，提示其增强了抗氧化和损伤监测信号，同时抑制促死亡/线粒体自噬信号。结论：NOFD在体内外模型中均显示出对RILI的明确保护作用，通过减轻氧化损伤、炎症反应和纤维化相关改变，并降低ROS积累和DNA损伤。HIF1A或HIF2A缺陷细胞的辐射敏感性增加，提示HIF相关调控参与细胞对辐射和NOFD处理的响应。这些发现将NOFD鉴定为缓解RILI的有前景候选药物。
