巨噬细胞炎症激活过程中不稳定血红素水平及血红素生物合成的动态改变

《Redox Biology》：Dynamic alterations in labile heme levels and heme biosynthesis during inflammatory activation of macrophages

　　

血红素是一种具有双重生物学功能的含铁四吡咯。虽然它作为各种血红素蛋白(血红蛋白和细胞色素c等)的必需辅基，但血红素在其“游离”、非蛋白结合的形式下具有细胞毒性。不稳定血红素(Labile heme, LH)代表细胞内生物可利用的血红素部分，易于交换并整合入血红素蛋白中。为了研究该血红素部分在炎症激活的巨噬细胞中的调节作用，研究人员应用选择性荧光小分子H-FluNox在脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)刺激的小鼠骨髓衍生巨噬细胞(BMDMs)中进行LH检测。使用H-FluNox及其可穿透细胞的衍生物乙酰化(Acetylated, Ac)-H-FluNox进行的研究表明，经LPS处理后，活体BMDMs中的LH水平随时间依赖性降低。血红素合成的限速酶δ-氨基乙酰丙酸合酶1(δ-aminolevulinate synthase 1, ALAS1)的表达在LH降低的同时发生上调。对BMDMs亚细胞器的研究表明，与细胞质和细胞核相比，线粒体中的LH浓度显著更高。此外，含血红素的促炎酶诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的表达依赖于细胞内LH浓度。具体而言，在经药理学血红素合成抑制剂处理或缺乏核血红素传感器BACH1的BMDMs中，显示出LH降低，此时LPS依赖的iNOS诱导受到衰减。相比之下，在使用血红素合成底物δ-氨基乙酰丙酸盐酸(δ-aminolevulinate, ALA)处理而表现出LH水平升高的BMDMs中，LPS对iNOS的诱导能力明显更高。最后，药理学抑制琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase, SDH)会增加细胞内δ-氨基乙酰丙酸盐酸和LH的水平，这也与LPS对iNOS更高的诱导能力相关。总之，数据表明小鼠巨噬细胞中的细胞内LH受到炎症刺激的调节，并且对于血红素整合入血红素蛋白iNOS至关重要。因此，血红素的可用性可作为代谢途径与炎症途径之间的调节纽带。

血红素作为一种含铁四吡咯，不仅是多种携氧和电子结合蛋白（如血红蛋白和细胞色素c）不可或缺的辅基，同时在“游离”状态下表现出促氧化、促炎和细胞毒性。细胞内被称为不稳定血红素(LH)的生物可利用部分，被提出作为血红素快速整合入细胞内血红素蛋白的交换源。尽管LH概念已被提出，但长期以来缺乏可行的检测方法限制了对细胞内血红素稳态的深入研究。此外，在巨噬细胞这一参与免疫调节的异质性单核细胞群体中，胞外血红素可诱导炎症激活，但胞内血红素的调节功能尚不明确。为更好理解巨噬细胞中胞内血红素稳态的作用，研究人员开展了相关研究，发现LH在炎症激活过程中发生动态变化并调节iNOS的表达与功能成熟。该研究揭示了血红素可用性作为代谢与炎症网络连接枢纽的作用，论文发表在《Redox Biology》。

研究人员主要采用选择性荧光小分子探针H-FluNox及其具有细胞穿透性的衍生物Ac-H-FluNox对LPS刺激的小鼠BMDMs及细胞提取物进行LH水平的定性和定量检测；通过药理学抑制剂处理或添加底物以调控血红素合成与分解代谢通路，利用免疫印迹和亚细胞器分离技术探究血红素合成限速酶ALAS1及亚细胞定位的变化机制；样本队列来源于从10-14周龄野生型和经过10代以上回交的BACH1^-/-小鼠（获自Tohoku University）胫骨和股骨中分离并培养的BMDMs。

在“LPS刺激BMDMs中细胞内LH水平随时间降低”的研究中，通过Ac-H-FluNox活细胞成像和H-FluNox荧光测定，发现LPS刺激导致LH水平随时间依赖性下降，但同时伴随总血红素含量的轻微上升。此外，通过免疫印迹分析发现，heme合成的限速酶ALAS1表达随LH的下降而上调，血红素降解酶HO-1与hemoprotein iNOS也被诱导表达，且iNOS的上调早于HO-1，表明BMDMs对LPS的反应伴随LH耗竭和血红素代谢相关酶的时序性改变。

在“ALAS1依赖的LH调节改变BMDMs中的LPS反应”的研究中，通过使用琥珀酰丙酮(SA)抑制δ-氨基乙酰丙酸盐酸脱水酶或N-甲基原卟啉IX(NMPP)抑制铁螯合酶，以及添加ALAS1的底物ALA进行处理，得出结论：抑制血红素合成会降低LH并协同增强LPS介导的ALAS1表达，而添加底物ALA则阻止了LPS引起的LH下降。这表明BMDMs对LPS的反应特征在于Toll样受体4(TLR4)信号传导与内源性LH之间通过酶促合成的相互调节。

在“LPS刺激的BMDMs亚细胞区室中LH和ALAS1表达变化”的研究中，通过亚细胞分离与免疫荧光分析，表明静息状态下BMDMs的LH在线粒体中水平远高于细胞核和细胞质，LPS刺激后会显著导致线粒体与细胞核中LH的降低，且ALAS1在LPS刺激下在线粒体中高表达，证实了LPS诱导的LH消耗是一个局限于线粒体的高度定位事件。

在“BACH1缺陷型BMDMs中的LH和ALAS1表达”的研究中，通过对比野生型与BACH1^-/-小鼠的BMDMs，发现BACH1^-/-细胞因组成型高表达HO-1而表现出LH水平显著降低，且在静息和LPS刺激状态下均伴有更高水平的ALAS1表达。这表明当细胞内LH低于某一阈值时，巨噬细胞会通过诱导ALAS1表达来补偿并增加血红素合成。

在“LH影响BMDMs中LPS依赖的iNOS诱导”的研究中，通过Griess试剂法和免疫印迹分析，发现使用SA和NMPP降低LH会大幅削弱LPS诱导的iNOS表达和亚硝酸盐（NO）生成，反之使用ALA增加LH则显著增强iNOS的诱导。BACH1^-/-巨噬细胞同样表现出LPS诱导iNOS能力的受损。这提供了非药理学证据，表明LH的可用性是iNOS从头合成的关键，且这种调节特异性针对iNOS而非白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α等其他炎症介质。

在“抑制琥珀酸脱氢酶(SDH)导致BMDMs中LH增加”的研究中，使用DMM抑制SDH，发现DMM处理可提高细胞内琥珀酰辅酶A和ALA水平，从而在LPS刺激时维持较高的LH水平，并显著增强iNOS的表达与功能活性，进一步证实了线粒体代谢重编程与heme biosynthesis之间存在强烈的相互依赖性。

最后，在讨论与结论部分，研究人员进一步阐明了血红素可用性与免疫调节之间的框架。在炎症激活的早期，LPS刺激引起线粒体LH的快速耗竭，这部分释放的LH可能被转移整合入新合成的apo-hemoprotein iNOS中，从而支持其功能性成熟与NO的产生；而在炎症晚期，作为应激反应主调节因子的NRF2表达增加，上调HO-1和ferritin以降解过量的促氧化heme并限制氧化损伤。研究指出，LH水平的下降会被细胞感知并触发限速酶ALAS1的表达上调，以还原内源性heme库。此外，核内血红素传感器BACH1作为LH的感应器，与NRF2协同调节HO-1表达，其缺失会导致LH被持续消耗。综上所述，研究人员得出结论：使用H-FluNox探针证明了LPS刺激会特异性下调巨噬细胞尤其是线粒体中的LH水平。炎症巨噬细胞中存在紧密协调的时序调节反应，涉及血红素降解和生物合成；ALAS1表达的增加是补充炎症期间内源性heme的必要机制。LH-ALAS1轴下游耦联iNOS蛋白的组装，并受转录调节因子BACH1的调控。总之，血红素可用性可作为关键的代谢节点调节巨噬细胞功能并连接代谢与免疫网络。