《Redox Biology》：Melatonin reprograms antioxidant defenses to suppress ferroptosis via Homer1a/mGluR1-Nrf2/xCT signaling after retinal ischemia-reperfusion
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褪黑素（Melatonin, Mel）不仅通过经典受体Mt1/Mt2发挥抗氧化和抗铁死亡效应，还通过代谢型谷氨酸受体1（metabotropic glutamate receptor 1, mGluR1）/谷氨酸介导的信号通路发挥作用。然而，Mel在视网膜缺血
褪黑素（Melatonin, Mel）不仅通过经典受体Mt1/Mt2发挥抗氧化和抗铁死亡效应，还通过代谢型谷氨酸受体1（metabotropic glutamate receptor 1, mGluR1）/谷氨酸介导的信号通路发挥作用。然而，Mel在视网膜缺血?再灌注（ischemia?reperfusion, I/R）损伤中调节mGluR1/谷氨酸信号的机制及其对铁死亡与氧化应激的下游效应仍不清楚。本研究通过批量RNA测序（bulk RNA sequencing）发现，视网膜I/R后Mel受体Mt1/Mt2以及铁死亡/铁氧化还原调节因子（Gpx4、Fth1和xCT）显著下调。Mel改善I/R后的视网膜结构与视功能、视引导行为及电生理反应，同时降低铁死亡与炎症损伤标志物，而这些获益被Mel膜受体拮抗剂大部分消除。在机制上，Mel在体内与体外以受体依赖方式上调Homer1a。转基因小鼠条件性敲除Homer1a以及视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells, RGCs）中敲低Homer1a，消除了Mel对视功能及其抗铁死亡、抗炎活性的保护作用。分子对接与共免疫沉淀实验表明，Mel恢复Homer1a与mGluR1的相互作用并激活xCT/GSH/Gpx4抗氧化轴。应用丁硫氨酸亚砜胺（buthionine sulfoximine, BSO）药理学抑制xCT或基因干扰xCT表达均抵消了Mel的保护效应。Mel还通过Homer1a/mGluR1依赖方式增强Nrf2介导的xCT转录表达。综上，研究结果定义了Mel?Homer1a/mGluR1?Nrf2/xCT信号级联，通过在I/R后抑制铁死亡/铁氧化还原反应促进RGCs存活，从而为I/R相关视网膜损伤的受体靶向干预提供了潜在可转化策略。
该研究发表于《Redox Biology》。目前视网膜缺血?再灌注（I/R）损伤会诱发氧化应激，导致视网膜神经节细胞（RGCs）等功能性视网膜细胞损伤或死亡，并通过膜脂质持续氧化启动自我放大的脂质过氧化级联反应，加重细胞损伤与死亡，其核心机制与铁死亡密切相关。细胞核因子红系2相关因子2（Nrf2）/xCT（亦称溶质载体家族7成员11，SLC7A11）是抗氧化防御系统的关键组分，可上调多种参与抗氧化与氧化还原稳态的基因，若视网膜I/R后不能建立足够或持续的Nrf2驱动反应，脂质过氧化链式反应更易随时间放大，增加铁死亡易感性。Nrf2并非独立激活，其上游调控常依赖受体?信号复合物塑造细胞反应动力学，神经系统中损伤刺激诱导的代谢失调，尤其是代谢型谷氨酸受体1（mGluR1）介导的谷氨酸失衡，可能是诱导Nrf2改变、触发细胞氧化应激与铁死亡的主要因素之一；延长反复的谷氨酸异常可导致Nrf2信号耗竭，削弱xCT对抗氧化应激与铁死亡的能力，异常升高的兴奋性氨基酸还可过度激活mGluR1，触发活性氧（ROS）与氧化应激信号的上游放大，且mGluR1下游激酶如蛋白激酶C（PKC）可磷酸化Nrf2，促进其从胞质转位至核内并结合抗氧化反应元件，启动抗氧化基因转录。褪黑素（Mel）是可调节mGluR活性与谷氨酸信号的自然分泌的睡眠调节抗氧化激素，但尚无研究阐明Mel是否通过调节mGluR1介导的谷氨酸失衡来发挥抗视网膜I/R损伤的抗氧化与神经保护效应。为此，研究人员利用转基因小鼠、批量RNA测序、视觉电生理与分子生物学技术，探究mGluR1介导的谷氨酸水平变化及其对氧化应激与铁死亡的调控，聚焦Mel通过该信号通路介导的抗氧化与神经保护功能及调控机制，为I/R后再灌注窗内强化抗氧化防御提供理论与潜在干预策略。
作者为开展研究用到的主要关键技术方法包括：使用8周龄雄性C57BL/6J小鼠（上海模型动物中心）作为动物样本；构建RGCs特异性条件性Homer1a敲除小鼠（TG小鼠，通过AAV/DJ?mSncg?Cre玻璃体注射实现）；建立小鼠视网膜I/R体内模型（前房插管维持眼压110 mmHg 1小时）与原代RGCs氧?糖剥夺/再灌注（OGD/R）体外模型；设计构建慢病毒与腺相关病毒（AAV）载体用于基因敲低/过表达；进行视觉电生理评估（ERG与F?VEP）；检测MDA、4?HNE、GSH、SOD、ROS、谷氨酸、Fe2+水平；开展批量RNA测序；进行细胞与视网膜切片免疫荧光、MTT、TUNEL、Western blotting、RT?PCR、H&E染色、共免疫沉淀、明暗箱测试、ELISA；检测线粒体膜电位（JC?1）、脂质过氧化（C11 BODIPY 581/591）、碘化丙啶（PI）染色、染色质免疫沉淀（ChIP）、双荧光素酶报告实验、透射电镜（TEM）、分子对接与分子动力学模拟；采用GraphPad Prism 8进行统计分析。
研究结果如下：
3.1 The Mel receptor genes Mt1/Mt2 and the ferroptosis regulators were significantly downregulated after retinal I/R injury
研究人员对假手术与I/R小鼠视网膜进行批量RNA测序，火山图显示I/R后转录重编程明显，Mt1/Mt2、铁死亡调节因子Gpx4与铁蛋白重链1（Fth1）显著下调，炎症基因如IL?18、TNF?α明显上调；气泡图显示I/R后铁代谢与氧化还原稳态相关基因Acsl3、Tfr1、Fth1、Gpx4、xCT明显失调，提示Mel与铁死亡相关；后续用Mel膜受体抑制剂Luzindole（Luz）与4?P?PDOT（4P）研究发现，Mel减轻I/R诱导的视网膜功能障碍与铁死亡依赖于Mel膜受体。
3.2 Mel treatment alleviated retinal structural abnormalities and dysfunction following retinal I/R injury
研究人员先确定300 μg/kg为无显著结构毒性的最高安全Mel剂量，且I/R后第3天起Mt1/Mt2表达稳定下调；功能上Mel改善明暗箱表现，提高F?VEP的P2波幅与ERG的O2、a波、b波幅，共给予Luz或4P大幅消除这些效应，表明Mel功能保护具强受体依赖性；分子层面I/R降低Mt1/Mt2、Gpx4、Fth1、FPN1、xCT，升高ACSL4、PTGS2、Tfr1、DMT1，Mel逆转这些变化而Luz或4P部分或完全抵消；I/R还伴MDA、4?HNE升高，GSH、SOD耗竭，不稳定Fe2+蓄积与Gpx4免疫反应性降低，Mel显著逆转而被受体阻断削弱，同时Mel将视网膜细胞因子微环境转向抗炎（升高IL?10，抑制TNF?α、IL?1β、IL?18、IL?6），受体拮抗后消失，表明Mel通过受体依赖信号维持铁氧化还原稳态抑制I/R诱导的铁死亡与炎症。
3.3 Mel attenuated OGD/R?induced ferroptosis and mitochondrial dysfunction in RGCs through Mel membrane receptor?dependent mechanism
研究人员先通过免疫荧光确认原代RGCs为Brn?3a与βIII?tubulin阳性，确定50 μM Mel处理24小时适用于OGD/R实验；透射电镜显示OGD/R后RGCs线粒体收缩、嵴丢失、膜密度增加等铁死亡超微结构特征，Mel大体保留线粒体结构而被Luz或4P削弱；OGD/R降低Gpx4、Fth1、FPN1、xCT，升高ACSL4、PTGS2、Tfr1、DMT1，增加ROS与Fe2+蓄积，崩解线粒体膜电位，增强脂质过氧化（C11?BODIPY氧化增加、MDA与4?HNE升高、GSH与SOD耗竭）并触发炎症活化（升高TNF?α、IL?1β、IL?18、IL?6，降低IL?10），Mel抑制这些铁死亡指标而Luz与4P削弱其保护；表明Mel通过膜受体依赖信号限制OGD/R诱导的RGCs铁死亡、线粒体功能障碍与炎症活化。
3.4 Mel upregulated Homer1a expression both in vivo and in vitro in a Mel membrane receptor?dependent manner
研究人员对损伤后Mel处理组与溶剂组进行转录组差异表达分析，无监督聚类显示两组表达谱明显分离，基因本体富集显示差异基因富集于突触相关结构与功能；突触相关基因中Homer1a在Mel组显著上调；体内I/R模型中Western blotting与RT?PCR显示Mel显著提升Homer1a转录与蛋白水平，免疫荧光确认Mel增加Homer1a阳性RGCs比例，而Luz或4P共处理大幅削弱该增加；体外OGD/R模型得到一致结果，表明Mel在体内外损伤模型中均以Mel膜受体依赖方式上调突触相关分子Homer1a。
3.5 Homer1a mediated the protective effects of Mel against retinal I/R injury in WT and TG mice
研究人员用已构建的Homer1a条件敲除小鼠（TG）与野生型（WT）小鼠，经PCR验证敲除效率，免疫荧光确认AAV/DJ?mSncg?Cre实现RGCs特异性Homer1a敲除（由91.61%降至11.07%）且不影响Homer1b/c，无胶质细胞与小胶质细胞脱靶；功能评估显示Mel显著提高WT小鼠I/R后F?VEP的P2波幅与ERG的O2、a波、b波幅，纠正明暗箱行为异常，而TG小鼠中这些改善不再显著，表明Homer1a对Mel的视觉保护效应至关重要；分子上Mel在WT视网膜减弱铁死亡与炎症损伤（恢复Gpx4、Fth1、xCT，降低Fe2+蓄积，增强Gpx4免疫反应性，减少RGC层死亡，降低MDA、4?HNE，升高GSH、SOD，下调TNF?α、IL?1β、IL?18、IL?6并升高IL?10），而在TG小鼠中大体丧失，表明RGCs内在的Homer1a是Mel抗I/R视网膜损伤保护效应的关键决定因子，缺失Homer1a会显著削弱Mel维持视功能与抑制铁稳态失调、脂质过氧化、细胞死亡与炎症的能力。
3.6 Homer1a knockdown abolished the anti?ferroptotic and anti?inflammatory effects of Mel in RGCs subjected to OGD/R
研究人员在OGD/R前沉默原代RGCs中Homer1a，在sh?Control细胞中Mel保留线粒体超微结构，恢复Gpx4、Fth1、xCT表达，降低ROS与Fe2+蓄积，稳定线粒体膜电位，限制C11?BODIPY氧化；而Homer1a敲低后这些效应被大幅削弱或消除；Mel在sh?Control RGCs中还恢复氧化还原稳态（降低MDA、4?HNE，升高GSH、SOD）并抑制炎症（降低TNF?α、IL?1β、IL?18、IL?6，升高IL?10），Homer1a敲低后未见此效应；表明Homer1a对Mel介导的RGCs保护不可或缺，将Mel信号与OGD/R期间线粒体维持及抑制铁死亡、氧化损伤和炎症相关联。
3.7 Mel reinforced Homer1a/mGluR1 coupling to restrain ferroptosis after retinal I/R injury
研究人员通过三维结构建模与分子对接预测Mel与mGluR1胞外入口区结合自由能?7.016 kcal/mol，Homer1a与mGluR1胞内侧（C端尾）形成更稳定界面（结合自由能?27.2 kcal/mol）并在模拟中维持构象稳定，Mel与Homer1a无生产性结合可能，推测Mel结合mGluR1胞外侧后调节胞内mGluR1/Homer1a复合物；共免疫沉淀证实视网膜I/R明显削弱Homer1a/mGluR1相互作用，而Mel在体内与OGD/R原代RGCs中恢复该关联；Mel显著降低I/R与OGD/R后谷氨酸蓄积，而药理学激活mGluR1逆转此效应；功能上mGluR1激活消除Mel抑制脂质过氧化与细胞死亡的能力（恢复C11?BODIPY氧化、增加PI阳性细胞、升高MDA与4?HNE、降低GSH与SOD、减弱Mel对xCT与Gpx4的上调及对ACSL4与PTGS2的下调），表明Mel通过加强Homer1a/mGluR1耦合限制病理性谷氨酸能信号，将Homer1a依赖的受体调控与抑制I/R后铁死亡、氧化损伤及RGCs死亡相联系。
3.8 Pharmacologic simulation of xCT loss with BSO or interference with xCT expression counteracted for Mel?mediated ferroptosis resistance in RGCs
研究人员聚焦系统Xc?核心组分xCT，通过AAV/DJ体内与慢病毒体外操作有效下调或上调视网膜与RGCs中xCT表达；视网膜I/R下Mel显著减少RGC层PI阳性细胞死亡，抑制MDA与4?HNE蓄积，恢复GSH与SOD活性，而xCT敲低大体消除这些效应；xCT过表达部分模拟Mel的抗氧化与抗铁死亡作用并进一步保护脂质过氧化与细胞死亡；药理学用BSO耗竭GSH逆转Mel保护（增加C11?BODIPY氧化、MDA与4?HNE、PI阳性死亡，降低GSH与SOD）；用经典Gpx4抑制剂RSL3诱导铁死亡，在视网膜组织与RGCs中引发强烈脂质过氧化、氧化应激与细胞死亡，Mel明显减轻这些变化而xCT敲低大幅削弱保护，Fer?1可有效抑制RSL3诱导的损伤，BSO模拟xCT缺失抵消Mel保护，表明完整xCT依赖的谷胱甘肽代谢是Mel介导抑制铁死亡所必需，xCT是Mel介导受伤RGCs保护的关键下游效应因子，将谷胱甘肽依赖抗氧化能力与抑制脂质过氧化及铁死亡损伤相联系。
3.9 Mel activated the Nrf2?xCT antioxidant program through Homer1a?dependent restraint of mGluR1 signaling
研究人员发现视网膜I/R后Nrf2蛋白随时间下调（第3天起明显并持续），与Homer1a变化时间模式平行；GTRD启动子分析在xCT启动子区发现若干推定Nrf2结合位点；染色质免疫沉淀显示I/R后Nrf2与xCT启动子结合减弱而Mel处理后增强；双荧光素酶报告显示Nrf2增强xCT启动子驱动的转录活性；在Homer1a敲除小鼠过表达Nrf2可部分逆转Mel对铁死亡标志物（MDA、4?HNE、GSH、SOD、ROS）与蛋白（Gpx4、Fth1、FPN1、xCT、ACSL4、PTGS2、Tfr1、DMT1）的影响，恢复Mel抗铁死亡效应；Western blotting显示Mel显著上调I/R后Nrf2及其下游Nqo1、HO?1，而Homer1a缺失/敲低或mGluR1药理激活抑制此效应；进一步检测mGluR1下游PKC与Nrf2 Ser40磷酸化及核转位发现，干预Homer1a或mGluR1降低Nrf2 Ser40磷酸化，抑制其胞质至核转位及与抗氧化反应元件结合，破坏抗氧化基因转录；mGluR1激动剂通过Homer1a缺失或敲低增加的脂质过氧化部分消除Mel抗氧化效应；表明Nrf2?xCT轴是Homer1a/mGluR1依赖的Mel抗氧化与抗铁死亡作用的下游调控组分，Mel通过Homer1a/mGluR1?Nrf2/xCT信号通路增强RGCs抗氧化与抗铁死亡能力。
讨论部分总结：本研究发现在视网膜I/R后Mel受体Mt1/Mt2与关键铁死亡/铁氧化还原调节因子（Gpx4、Fth1、xCT）明显下调；功能上Mel显著保留视网膜结构与视功能、增强视引导行为并恢复视网膜电生理反应；机制上Mel增加Homer1a表达、恢复Homer1a/mGluR1耦合并激活xCT/GSH/Gpx4抗氧化轴，药理学抑制xCT消除Mel获益，且Mel以Homer1a/mGluR1/Nrf2依赖方式促进xCT转录；共同定义Mel?Homer1a/mGluR1?Nrf2/xCT信号级联通过在I/R后抑制铁死亡与铁相关氧化还原失衡保障RGCs存活，为再灌注窗内强化抗氧化防御提供理论与潜在干预策略。关键发现是Mel信号整合于Homer1a/mGluR1依赖的谷氨酸能控制以调控下游氧化应激；Homer1a介导Mel对mGluR1的依赖调控，将膜受体信号与铁死亡调控相连，Mel增强Homer1a/mGluR1耦合而I/R削弱此相互作用，与既往Homer1a和Homer1双向调控mGluR1一致，并为Mel通过限制上游病理性谷氨酸能信号协调线粒体功能障碍、铁氧化失衡、脂质过氧化与炎症失调提供机制解释；谷氨酸是RGCs铁死亡应激的上游放大器，为靶向视网膜I/R后氧化应激与铁死亡提供新框架。结果表明xCT/GSH/Gpx4轴构成Mel介导抗铁死亡的核心机制，破坏xCT或耗竭GSH显著削弱Mel保护而上调xCT部分恢复，提示Mel保护依赖于维持硫醇依赖抗氧化代谢，靶向xCT/GSH/Gpx4轴与其上游受体信号可协同。进一步确认Mel通过Homer1a/mGluR1通路调控Nrf2介导抗氧化程序并在转录水平选择性增强xCT启动子活性；Nrf2有效激活与抗氧化转录建立不仅取决于Mel，还依赖Homer1a完整性与mGluR1适当调控，因此Homer1a/mGluR1是Nrf2驱动抗氧化转录的关键上游模块，该层级信号结构将兴奋信号与铁死亡相关生化途径整合，通过统一机制级联协调抗氧化转录。本研究不仅描绘Mel抗铁死亡分子机制，还揭示其治疗效应可能受受体可用性、突触功能与转录执行三层面制约：I/R下调Mt1/Mt2，Mel获益依赖Mt1/Mt2并被Luz与4P抑制，提示再灌注早期即使给予外源Mel也因受体亚型不足与脱靶限制信号级联启动强度与持续时间，疗效取决于配体可及性与功能受体信号保留及下游信号时间匹配；mGluR1参与表明铁死亡不仅由 redox失调驱动，也可通过突触与兴奋信号通路动态调控，I/R后谷氨酸能信号失调可能通过受体介导信号改变铁死亡易感性决定因子（脂质过氧化放大与抗氧化代谢底物供应），受体耦合改变可能通过兴奋信号调制脂质过氧化阈值与底物蓄积；铁死亡调控不仅靠抑制ROS产生，还依赖功能性xCT/GSH/Gpx4轴，其启动与维持与Nrf2介导转录激活偶联——代谢层面xCT提供半胱氨酸摄取与支持GSH合成决定抗氧化缓冲池是否充足，转录层面Nrf2驱动xCT及其下游抗氧化基因表达决定是否可持续维持抗氧化机器，代谢底物缺乏则即使瞬时转录激活也无法形成有效动态缓冲，转录执行不足则削弱早期代谢补偿持续性；Mel通过受体/突触支架/Nrf2轴统一两途径并维持更稳定抗铁死亡表型，凸显再灌注窗内持续强效抗氧化重编程的重要性。尽管本研究通过C11?BODIPY、Fe2+、铁死亡相关蛋白、RSL3/Fer?1干预与TEM形态学较全面表征铁死亡表型，但尚不足以直接证明I/R微环境中无其他细胞死亡模式缺席或可忽略，凋亡、坏死性凋亡与炎症相关细胞死亡各有特征，本研究支持Homer1a/mGluR1相关信号与铁死亡表型明确关联并具有功能相关性，但认为铁死亡是I/R损伤中已验证的关键机制而非所有细胞死亡模式的唯一解释。治疗方案设计考量剂量、给药途径与时机：选用300 μg/kg腹腔注射Mel基于文献最大安全剂量与预实验，平衡疗效与安全且无显著毒性或行为异常；腹腔注射优于玻璃体注射（操作简便、重复性好、感染风险低，且Mel可跨血?视网膜屏障达治疗浓度，适合长期重复给药）；I/R后即刻开始每日给药连续14天覆盖急性损伤期（氧化爆发、炎症级联与早期凋亡核心窗）及后续慢性修复重塑阶段（神经元突触再生、胶质瘢痕形成与内源性抗氧化系统长期适应），更全面评估Mel累积保护与长期安全，临床多数视网膜缺血性疾病患者在症状数小时内就诊，提供现实可行窗以启动Mel干预，符合“时间即视网膜”原则，但需考虑患者就诊延迟、大动物研究与临床试验进一步评估慢性Mel对昼夜节律、内分泌与药物代谢酶影响。尽管系列功能实验确立该通路不可或缺，仍存在若干问题：Mel调节昼夜节律与行为可能混淆视觉行为读数（如明暗箱），虽同步行视觉电生理，未来需增补视觉相关行为实验；临床视网膜缺血患者常在缺血数小时后就诊，需考察治疗时间窗以客观评估转化价值；本研究定义Homer1a为Mt1/Mt2激活的关键枢纽，但Mel与Homer1a间详细调控机制不清，后续将沿Mt1/Mt2下游候选通路验证Homer1a转录与翻译机制；所述整合框架为临床转化奠基，靶向Mel受体信号恢复Homer1a/mGluR1耦合并增强Nrf2/xCT抗氧化转录程序，或可成为将I/R视网膜损伤中不可逆铁死亡转向可干预抗铁死亡稳态的潜力策略。
研究结论部分翻译：本研究发现在视网膜缺血?再灌注（I/R）后，褪黑素（Mel）受体Mt1/Mt2以及关键铁死亡/铁氧化还原调节因子（Gpx4、Fth1与xCT）显著下调。在功能上，Mel显著保留视网膜结构与视功能、增强视引导行为并恢复视网膜电生理反应。在机制上，Mel增加Homer1a表达、恢复Homer1a/代谢型谷氨酸受体1（mGluR1）耦合并激活xCT/谷胱甘肽（GSH）/谷胱甘肽过氧化物酶4（Gpx4）抗氧化轴。与之相一致的是，xCT的药理学抑制消除了Mel的有益效应。此外，Mel以Homer1a/mGluR1/核因子红系2相关因子2（Nrf2）依赖方式促进xCT转录。综上所述，这些发现定义了一个Mel?Homer1a/mGluR1?Nrf2/xCT信号级联，其通过在I/R后抑制铁死亡与铁相关氧化还原失衡来保障视网膜神经节细胞（RGCs）存活，从而为I/R相关视网膜损伤的受体靶向干预提供了一种潜在的可转化策略。
