NADPH氧化酶2（NOX2）非依赖性的中性粒细胞胞外陷阱诱导物促进慢性炎症的消退

《Redox Biology》：NADPH oxidase 2 (NOX2)-independent inducers of neutrophil extracellular traps promote resolution of chronic inflammation

　　

由NADPH氧化酶2（NOX2）产生的活性氧（ROS）对于抗菌防御以及炎症消退至关重要。NOX2缺乏，如在慢性肉芽肿病（CGD）中所观察到的，易导致持续性无菌性炎症。当前的治疗策略主要依赖于非特异性免疫抑制或需要残余的NOX2活性，而全身性ROS诱导疗法则受限于毒性。在此，研究人员提出一种NOX2非依赖性的方法，利用N-烷基氨基二茂铁前药（pro-NAAFs）来恢复炎症消退性ROS信号，这些前药可放大预先存在的ROS，而非无差别地产生ROS。在多个候选物中，前药1（prodrug 1）成为最有效且耐受性良好的ROS放大器。在人中性粒细胞中，前药1诱导了强烈的ROS产生和中性粒细胞胞外陷阱（NET）形成。这些反应不依赖于NOX2，并在CGD来源的中性粒细胞中得以维持。在野生型和NOX2功能失调的Ncf1^**小鼠的免疫细胞中也观察到类似的NOX2非依赖性ROS诱导和NET形成。前药1诱导的NET聚集成高密度结构（aggNETs），能够在体外降解促炎介质。前药1还抑制了中性粒细胞炎症小体激活。在体内，皮下给予前药1降低了气囊中的炎症介质水平，促进了Ncf1^**小鼠慢性关节炎的消退，并防止了骨破坏。转录组学分析表明，前药1早期抑制了炎症通路，并将中性粒细胞成熟轨迹恢复至野生型样状态。虽然前药1增加了蛋白质氧化标志物，但它将全身性氧固醇谱转向炎症消退表型。这些发现将pro-NAAFs确定为NOX2非依赖性的ROS放大器，能够恢复炎症消退，并强调了它们在NOX2功能障碍相关的慢性炎症状态中的治疗潜力。

**论文解读：NOX2非依赖性ROS放大器通过诱导中性粒细胞胞外陷阱促进慢性炎症消退**

**研究背景与问题**

活性氧（ROS）在免疫防御和炎症消退中扮演双重角色。NADPH氧化酶2（NOX2）是吞噬细胞产生ROS的核心酶，其功能缺陷（如慢性肉芽肿病（CGD）患者）会导致持续性无菌性炎症，并增加关节炎、系统性红斑狼疮等慢性炎症性疾病的风险。现有治疗策略主要依赖非特异性免疫抑制（如糖皮质激素）或需要残余NOX2活性，而系统性ROS诱导剂（如PEG化D-氨基酸氧化酶）因引发广泛氧化应激和毒性，临床应用受限。因此，亟需一种NOX2非依赖性、且能局部放大炎症组织中ROS的疗法，以恢复炎症消退功能。

**研究目的与意义**

本研究旨在探索N-烷基氨基二茂铁（NAAF）前药（pro-NAAFs）作为NOX2非依赖性ROS放大器，能否在NOX2功能不全的条件下诱导中性粒细胞胞外陷阱（NETs）形成，并促进慢性炎症消退。论文发表在《Redox Biology》。研究证实，代表性前药1（prodrug 1）在体外和体内均能有效放大预先存在的ROS，诱导NETs聚集为高密度AGGNETs（aggNETs），降解促炎介质，抑制炎症小体激活，并改善NOX2功能失调小鼠的慢性关节炎，为NOX2缺陷相关炎症提供了潜在治疗策略。

**关键技术与方法**

研究人员采用化学合成优化前药1（盐酸盐形式，纯度>95%），从人正常健康供者（NHDs）和CGD患者（3例）外周血分离中性粒细胞，以及从野生型（WT）和NOX2功能失调Ncf1^**小鼠（BALB/c.Q背景，携带Ncf1基因突变）骨髓和血液中分离免疫细胞。主要技术包括：流式细胞术检测细胞内ROS（CM-H2DCFDA、mitoSOX探针）、化学发光法（luminol/isoluminol）测量总ROS和胞外ROS、SytoxGreen荧光法检测胞外DNA（NETs标志）、荧光显微镜和ImageStream成像验证NETs、AGGNETs形成及蛋白降解实验（多重磁珠技术）、FLICA法检测caspase-1活性、MSU晶体诱导小鼠慢性关节炎模型（皮下注射）和气囊模型、皮下注射前药1（25mM，每日一次）、μCT分析骨破坏、bulk RNA-seq和单细胞RNA-seq（scRNA-seq）联合基因集富集分析（GSEA）及RNA速率分析、LC-MS/MS检测血浆氧固醇谱、比色法测定硼含量及蛋白羰基化水平。

**研究结果**

1. **Pro-NAAFs在分子氧存在下放大ROS**：前药1的激活机制依赖ROS响应性芳基硼酸酯基团，去除后生成NAAF，后者催化H₂O₂和O₂产生高活性ROS（HO^•和O₂^•-），并形成二茂铁阳离子（NAAF⁺），可被GSH、抗坏血酸等还原剂再生，形成催化循环。在低ROS条件下，髓过氧化物酶（MPO）可加速前药1激活。

2. **系列Pro-NAAFs诱导ROS和NET形成**：筛选三种前药（1、2和3），前药1诱导人中性粒细胞内ROS积累最强，且呈剂量依赖性。前药1还诱导胞外DNA释放（NETs），此效应不依赖NOX2（DPI预处理无影响）。前药3诱导的DNA释放更剧烈，但伴随细胞死亡标志增加。前药1在CGD患者中性粒细胞中同样诱导ROS和NETs，且在小鼠WT和Ncf1^**中性粒细胞中维持NOX2非依赖性活性。前药1还诱导单核细胞和CD3⁺T细胞ROS，但预刺激（PMA）可增强其在Ncf1^**细胞中的ROS输出。

3. **前药1诱导的AGGNETs降解炎症介质**：前药1刺激人中性粒细胞形成的AGGNETs能在体外降解重组细胞因子和趋化因子（如IL-6、TNF-α、CXCL10），类似PMA和MSU晶体诱导的AGGNETs。在Ncf1^**小鼠气囊模型中，前药1预处理显著降低促炎介质（如IL-1β、IL-6）水平。

4. **前药1抑制MSU晶体诱导的炎症小体激活并促进慢性关节炎消退**：前药1共孵育显著抑制LPS/MSU晶体刺激的人中性粒细胞caspase-1活性（FLICA法）和IL-1β释放。体内实验显示，皮下注射（而非静脉或腹腔注射）前药1能有效提高Ncf1^**小鼠中性粒细胞内ROS水平，并显著减轻MSU晶体诱导的慢性关节炎（表现为关节肿胀评分下降、骨破坏减轻），且停药后疗效仍持续。前药1在炎症组织中被消耗更多（硼含量降低，荧光成像证实）。

5. **转录组学分析揭示前药1的免疫调节机制**：bulk RNA-seq显示，前药1治疗早期（第2天）即抑制细胞增殖、细胞因子/趋化因子反应通路，并上调氧化磷酸化通路；慢性期（第14天）持续抑制炎症通路，并促进组织重塑通路。上游调控因子分析预测MYD88、CCL2、CCL5被抑制，而CISH、IL-10被激活。单细胞RNA-seq进一步揭示，前药1治疗将Ncf1^**小鼠关节中异常的中性粒细胞表型（偏向未成熟簇4）恢复至WT样状态（簇1主导），并抑制中性粒细胞脱颗粒、TNF-α和IFN信号通路。ROS调控基因集分析显示，前药1早期上调促胞质ROS调节因子，并持续上调促线粒体和抗线粒体ROS调节因子。

6. **前药1治疗将蛋白质氧化转向炎症消退表型**：前药1增加血清蛋白羰基化水平，但血浆氧固醇谱显示，促炎性7-酮胆固醇（7-ketoOHC）在关节炎小鼠中显著降低，而抗炎性25-羟基胆固醇（25OHC）升高。在健康小鼠中，前药1处理降低Ncf1^**小鼠血浆7-ketoOHC和25OHC，但不影响WT小鼠。

**讨论与结论**

研究讨论指出，pro-NAAFs通过激活依赖性、NOX2非依赖性机制放大ROS，优先在激活的炎症环境中发挥作用，诱导NETs和AGGNETs形成，抑制晶体诱导的炎症小体激活，从而恢复NOX2缺陷下的炎症消退功能。前药1在细胞内主要靶向溶酶体，但也显著诱导线粒体ROS，尤其在NOX2功能不全细胞中，提示线粒体可视为ROS富集环境。前药1对炎症小体的抑制作用提示其可能通过改变细胞氧化还原状态、损害代谢或吞噬功能来抑制NLRP3激活。尽管前药1增加蛋白质氧化标志物，但伴随的氧固醇谱变化（7-ketoOHC降低、25OHC升高）表明其整体氧化应激具有方向性，而非有害性。研究还强调，前药1的皮下给药途径可形成局部储库，避免全身性氧化毒性，且其在炎症组织中消耗增加，显示空间选择性。

**研究结论**：这些发现将pro-NAAFs确定为NOX2非依赖性的ROS放大器，能够恢复炎症消退，并强调了它们在NOX2功能障碍相关的慢性炎症状态中的治疗潜力。