慈姑（Sagittaria trifolia L.）块茎中两种新型水溶性多糖的纯化、表征及其对晶状体上皮细胞的有益作用

《Results in Chemistry》：Purification, characterization of two novel water-solubility polysaccharides from Sagittaria trifolia L. tuber and its beneficial effects on lens epithelial cells

　　

本研究旨在分离、表征并评估来自慈姑（Sagittaria trifolia L.）的多糖（STTP）的生物活性，重点研究其对抗糖尿病性白内障的潜在机制。研究人员获得了两种纯化组分STTP2和STTP3。结构表征，包括高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（HPAEC-PAD）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）和核磁共振（NMR），揭示两者均为α-连接的多糖，但具有不同的单糖组成和连接模式；STTP3表现出比STTP2更复杂的结构。体外抗氧化实验证实了它们强大的自由基清除能力。在模拟糖尿病性白内障病理的晚期糖基化终末产物（AGEs）诱导的HLE-B3细胞损伤模型中，STTP2和STTP3预处理均显著增强了细胞活力和增殖。机制研究表明，STTPs通过降低活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平，同时提高还原型谷胱甘肽（GSH）和过氧化氢酶（CAT）活性，缓解了氧化损伤。这种抗氧化效应与核因子E2相关因子2（Nrf2）/NAD(P)H醌氧化还原酶1（NQO1）/血红素加氧酶-1（HO-1）信号通路的激活有关。此外，STTPs通过上调去乙酰化酶SIRT1和SIRT6并下调p16、p21来延缓细胞衰老，并通过增加B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）/Bcl-2相关X蛋白（Bax）比值和稳定线粒体膜电位（MMP）来抑制凋亡。值得注意的是，STTP3在保护效果上始终优于STTP2。这些结果表明，STTP2和STTP3（尤其是STTP3）是通过抗氧化、抗衰老和抗凋亡等多靶点机制预防糖尿病性白内障的有前景的天然药物。

慈姑（Sagittaria trifolia L.）为泽泻科多年生草本植物，其块茎在传统中医中用作功能性食品和药材，具有清热、解毒、止咳等功效。研究表明，慈姑块茎含有多种活性成分，其中多糖含量约13.5%，是主要活性物质，初步研究显示其具有抗氧化、降血糖、保肝和免疫调节等作用。然而，目前对慈姑块茎多糖的纯化组分，尤其是其均一多糖的结构表征尚不清晰，且其抗白内障作用，特别是针对糖尿病性白内障的机制，尚未得到深入探究。白内障是糖尿病常见并发症，晶状体上皮细胞在氧化应激、细胞衰老和凋亡等病理过程中起关键作用。因此，本研究旨在从慈姑块茎中分离纯化两种新型水溶性多糖，全面表征其结构，并评估其在晶状体上皮细胞中的保护作用及潜在机制，为开发天然抗白内障药物提供科学依据。该论文发表在《Results in Chemistry》。

研究人员开展的研究：通过热水提取和乙醇分级沉淀获得粗多糖，经DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-100凝胶柱层析纯化，得到两种均一多糖STTP2和STTP3。采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（HPAEC-PAD）分析单糖组成，傅里叶变换红外光谱（FT-IR）鉴定官能团，气相色谱-质谱联用（GC-MS）进行甲基化分析确定糖苷键类型，一维和二维核磁共振（NMR）（包括¹H、¹³C、COSY、NOESY、HMBC、HSQC）解析连接序列。刚果红实验评估三股螺旋结构，扫描电子显微镜（SEM）观察微观形貌。体外抗氧化活性通过DPPH、ABTS、铁还原抗氧化能力（FRAP）和羟自由基清除实验测定。细胞实验采用人晶状体上皮B3（HLE-B3）细胞，建立晚期糖基化终末产物（AGEs）诱导损伤模型，通过CCK-8、EdU染色、JC-1、DCFH-DA、Western blot和免疫荧光等技术检测细胞活力、增殖、氧化应激、衰老和凋亡相关标志物。

研究结果如下：

3.1 制备与纯化分析：通过DEAE-52和Sephadex G-100层析获得STTP2和STTP3，总糖含量分别为97.46%和76.16%，紫外可见光谱（UV-vis）显示无核酸或蛋白质污染。尺寸排阻色谱-多角度激光光散射-示差折光检测（SEC-MALLS-RI）测得STTP2的重均分子量（Mw）为421.1 kDa，数均分子量（Mn）为154.6 kDa；STTP3的Mw为362.1 kDa，Mn为148.1 kDa，多分散指数分别为2.72和2.45，表明分子量分布相对均一。

3.2 单糖组成分析：HPAEC-PAD显示STTP2主要由葡萄糖（84.92%）组成，少量半乳糖、阿拉伯糖和鼠李糖；STTP3含有葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和甘露糖，摩尔比为51.50:20.99:15.85:7.88:2.05:1.73，表明STTP3结构更复杂。

3.3 FT-IR分析：两者均显示α-糖苷键的特征吸收峰（约840 cm^-1），以及吡喃糖环的C-O-C/C-O-H伸缩振动峰（1155-1020 cm^-1），表明均为α-连接多糖。

3.4 甲基化分析：GC-MS检测到STTP2和STTP3均含有1,4-葡萄糖、末端葡萄糖、1,4,6-葡萄糖等常见连接，STTP3额外含有1,3-半乳糖、末端鼠李糖、1,2-鼠李糖等，证实其分支结构更复杂。

3.5 NMR分析：通过¹H、¹³C及二维NMR谱图解析，STTP2主链由→4)-α-D-Glcp-(1→和→4,6)-α-D-Glcp-(1→交替组成，侧链为α-D-Glcp-(1→和α-L-Araf-(1→；STTP3共享相同主链，但侧链延伸，包括→3)-β-D-Galp-(1→和→5)-α-L-Araf-(1→等，形成更精细的重复单元。

3.6 形态学性质：刚果红实验显示，在0-0.5 M NaOH浓度下，STTP2和STTP3的最大吸收波长无显著红移，表明两者在溶液中均不存在稳定的三股螺旋结构。SEM观察显示，低倍率下两者均为光滑不规则块状，高倍率下STTP2表面多孔，STTP3表面相对光滑。

3.7 体外抗氧化活性：STTP2和STTP3对羟自由基、ABTS⁺自由基、DPPH自由基均呈浓度依赖性清除能力，并具有铁还原能力。在50 mg/mL时，STTP2和STTP3的羟自由基清除率分别为54.92%和60.71%；ABTS⁺清除率分别为32.05%和45.15%；DPPH清除率在10 mg/mL时分别为56.21%和61.87%。STTP3在各项指标上均略优于STTP2。

3.8 STTP抑制AGEs诱导的HLE-B3细胞毒性：CCK-8实验表明，0.25-2 mg/mL的STTP2或STTP3对细胞活力无影响，4 mg/mL时降低活力。0.8 mg/mL AGEs处理24 h导致细胞活力约下降50%。1 mg/mL STTP2或STTP3预处理24 h显著提高AGEs暴露后的细胞活力，STTP3恢复至88.78%，STTP2为81.69%。EdU染色进一步证实STTP预处理增强细胞增殖能力。

3.9 STTP缓解AGEs诱导的HLE-B3细胞氧化应激：与AGEs模型组相比，STTP2和STTP3预处理显著降低细胞内ROS和MDA水平，提高GSH含量和CAT活性，STTP3效果更优。

3.10 STTP激活Nrf2抗氧化通路：Western blot和免疫荧光结果显示，AGEs处理上调Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表达，STTP预处理进一步显著增强这些蛋白水平，表明STTP通过激活Nrf2/NQO1/HO-1通路增强抗氧化防御。

3.11 STTP通过SIRT1/SIRT6延缓衰老：AGEs处理导致SIRT1和SIRT6下调，p16和p21上调。STTP预处理逆转这些变化，上调SIRT1/SIRT6，下调p16和p21，表明STTP通过调节衰老相关信号延缓细胞衰老。

3.12 STTP抑制凋亡：AGEs处理增加Bax表达、降低Bcl-2表达，降低Bcl-2/Bax比值，并导致线粒体膜电位（MMP）下降。STTP预处理抑制Bax上调，促进Bcl-2表达，恢复Bcl-2/Bax比值，并稳定MMP，从而抑制线粒体途径凋亡，STTP3效果更显著。

总结讨论部分：本研究成功从慈姑块茎中分离纯化两种α-连接多糖STTP2和STTP3，通过结构表征明确了其单糖组成、糖苷键类型和连接序列。在AGEs诱导的HLE-B3细胞糖尿病性白内障模型中，两者通过多靶点机制发挥保护作用：激活Nrf2/NQO1/HO-1通路缓解氧化应激，调节SIRT1/SIRT6信号延缓衰老，以及通过恢复Bcl-2/Bax平衡和稳定MMP抑制凋亡。STTP3因其更复杂的结构（如更长的侧链和额外的糖残基）在各项生物活性中均优于STTP2，建立了清晰的结构-活性关系。研究结论：本研究成功从慈姑中分离并表征了两种α-连接多糖STTP2和STTP3。两者均具有相对均一的分子量，但单糖组成和连接复杂性不同，STTP3呈现更精细的结构。体外，STTP2和STTP3在多种实验（DPPH、ABTS、FRAP和羟自由基清除）中显示出显著抗氧化活性。在AGEs诱导的HLE-B