《Results in Chemistry》：Development and validation of new HSS-UPLC-ESI-MS/MS method for simultaneous quantification of organophosphate and pyrethroid pesticide metabolites in human urine
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有机磷酸酯（Organophosphates, OPs）和拟除虫菊酯（Pyrethroids, PYs）是农业中广泛使用的农药，可能严重影响人类健康。对于农药的生物监测，灵敏且准确的分析方法至关重要，但用于同时检测和定量的方法有限。研究人员提出了一种新开发和验
有机磷酸酯（Organophosphates, OPs）和拟除虫菊酯（Pyrethroids, PYs）是农业中广泛使用的农药，可能严重影响人类健康。对于农药的生物监测，灵敏且准确的分析方法至关重要，但用于同时检测和定量的方法有限。研究人员提出了一种新开发和验证的超高效液相色谱-串联质谱（Ultra-Performance Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry, UPLC-MS/MS）方法，该方法利用UPLC HSS T3色谱柱的能力，准确量化人尿中极性不同的常用农药代谢物。目标代谢物包括马拉硫磷二羧酸（malathion dicarboxylic acid, MDA）、3,5,6-三氯-2-吡啶醇（3,5,6-trichloro-2-pyridinol, TCPy）、3-苯氧基苯甲酸（3-phenoxybenzoic acid, 3-PBA）和4-氟-3-苯氧基苯甲酸（4-fluoro-3-phenoxybenzoic acid, 4-F-3-PBA）。分析物通过选择特定离子跃迁并在定义的保留时间窗口内进行鉴定。采用固相萃取（Solid-phase Extraction, SPE）进行样品净化，使用Oasis HLB柱作为吸附剂，乙腈作为洗脱溶剂。方法验证包括评估选择性、线性、灵敏度、准确度、精密度、回收率和基质效应。优化后，大多数分析物的回收率范围为60%至113%，准确度在80–120%之间，在定量下限（lower limit of quantification, LLOQ）处相对标准偏差低于20%。建立的LLOQ对于MDA和3-PBA为0.5?μg?L?1，对于TCPy和4-F-3-PBA为0.25?μg?L?1。最后，将该方法应用于一批来自摩洛哥农场工人的26份尿液样本，所有代谢物的检出频率超过80%。该方法在同时定量农药代谢物方面表现出高灵敏度，并成功应用于现场尿液样本，支持其在人类生物监测研究中的潜在应用。其应用于现场样本突显了其在大规模生物监测研究中的强大鲁棒性，并支持在人群中进行扩展风险评估。
**论文解读：基于UPLC-MS/MS同时定量人尿中有机磷酸酯和拟除虫菊酯农药代谢物的方法开发与验证**
**研究背景与问题**
有机磷酸酯（Organophosphates, OPs）和拟除虫菊酯（Pyrethroids, PYs）是全球农业中广泛使用的农药，用于控制害虫和提高作物产量。然而，接触这些农药与多种健康效应相关，包括DNA甲基化、氧化应激标志物改变，以及成人阿尔茨海默病、青少年神经发育障碍和儿童精神/心理运动发育迟缓等。农场工人因直接接触农药而面临更高的健康风险，症状包括头晕、头痛、恶心、皮肤和眼睛刺激，并可能进一步导致内分泌紊乱、呼吸系统疾病和多种癌症。鉴于这些健康问题，直接量化人体内农药残留至关重要，尤其是使用无创基质如尿液。目前，生物监测更侧重于测量农药代谢物，因为母体化合物代谢迅速，在生物基质中浓度低，而代谢物更稳定、丰度更高，且能反映不同途径和来源的综合暴露水平。然而，代谢物测量面临分析挑战，主要涉及不同极性和性质化合物的分离。传统气相色谱-质谱法（GC/MS）对极性、非挥发性或热不稳定化合物需衍生化，增加了样品制备复杂性。液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）虽有高灵敏度，但多数方法针对母体农药，且对代谢物的同时检测方法有限。因此，开展本研究的目的是开发并验证一种灵敏、可靠的方法，用于同时定量人尿中OP和PY代谢物，以支持大规模生物监测和风险评估。
**研究内容与结论**
研究人员开发并验证了一种基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的新方法，结合高强度硅胶T3（HSS T3）色谱柱和固相萃取（SPE）技术，同时定量人尿中四种目标代谢物：马拉硫磷二羧酸（MDA）、3,5,6-三氯-2-吡啶醇（TCPy）、3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）和4-氟-3-苯氧基苯甲酸（4-F-3-PBA）。通过优化质谱参数、色谱条件和萃取步骤，方法表现出良好的线性（决定系数R2>0.99）、灵敏度（定量下限LLOQ为0.25–0.5?μg?L
?1）、精密度（RSD<20%）、准确度（80–120%）和回收率（60–113%）。该方法应用于26份摩洛哥农场工人尿液样本，所有代谢物检出频率超过80%，证实了其在实际暴露评估中的可行性。论文发表在《Results in Chemistry》。
**关键技术方法**
研究人员主要采用以下关键技术：1）超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS），配备电喷雾电离源（ESI），在负离子模式下检测，使用UPLC HSS T3色谱柱（100??，1.8?μm，2.1?mm×50?mm）实现极性差异大的代谢物分离；2）固相萃取（SPE）样品前处理，采用Oasis HLB柱作为吸附剂，乙腈洗脱，并对酶解时间、洗脱体积等参数进行了优化；3）方法验证依据美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）指南，评估选择性、线性、灵敏度、精密度、准确度、回收率、基质效应和稳定性。样本队列来源为摩洛哥Meknes省农村地区的农场工人（26份尿液样本）。
**研究结果**
**3.1. 质谱（MS/MS）参数的优化**：通过直接进样分析物标准品，确定了每个代谢物的定量和定性离子跃迁，优化了毛细管电压（2.5?kV）、脱溶剂温度（650?°C）及气体流量，使信号响应最强。
**3.2. 液相色谱（UPLC）参数的优化**：比较了不同色谱柱（CORTECS UPLC HILIC、BEH C18和HSS T3），发现HSS T3柱对极性和非极性分析物均能实现最佳分离，获得合适的保留时间和峰形。流动相系统采用梯度洗脱，对OPs使用0.1%甲酸水/乙腈，对PYs使用5?mM甲酸铵水/0.01%乙酸乙腈，改善了峰高和对称性。
**3.3. 萃取方法的优化**：将内标用量降至2?ng以避免离子抑制，酶解时间缩短至1小时。比较Oasis HLB和Sep-Pak C18柱，HLB柱对两类农药代谢物均表现出一致性能。洗脱溶剂选择乙腈（6?mL）获得较高回收率，最终蒸发复溶步骤保证与色谱系统兼容。
**3.4. 方法验证**：**选择性**：多反应监测（MRM）模式实现选择性鉴定，空白基质无干扰峰。**线性**：校准曲线在0–50?μg?L
?1范围内线性良好（R2>0.99）。**灵敏度与定量限**：LLOD（检出限）为0.05–0.25?μg?L
?1，LLOQ为0.25–0.5?μg?L
?1，ULOQ为10–50?μg?L
?1。**精密度与准确度**：超过75%校准标准品的RSD<15%，准确度在85–115%内；LLOQ处RSD≤20%。**萃取效率**：回收率范围为60–120%，基质效应存在化合物特异性，但总体可接受。**稳定性**：分析物在长期冷冻、室温短期存放和冻融循环条件下保持稳定（偏差<15–20%）。
**3.5. 方法在实际样本中的应用**：对26份农场工人尿液样本分析，MDA、TCPy和4-F-3-PBA在84%样本中可定量，3-PBA在88%中可定量。浓度范围：MDA最高达6.33?μg?L
?1，4-F-3-PBA达5.50?μg?L
?1，3-PBA达3.12?μg?L
?1，TCPy最低（最大1.78?μg?L
?1），表明方法能检测广泛浓度范围。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本方法利用UPLC HSS T3柱的独特性质（低配体密度，增强极性化合物保留同时保持疏水性选择性），实现了极性差异大的代谢物同时分离。与现有方法相比，灵敏度优于部分研究，尤其在MDA回收率上得到显著改善（最高94.7% vs 文献34%）。实际样本中高检出率（>80%）证明方法在职业暴露评估中的实用性。局限性在于MDA存在轻微基质效应，需进一步优化内标校正。研究结论部分翻译如下：**结论**：本研究聚焦于开发一种新方法，用于定量人尿中有机磷酸酯和拟除虫菊酯农药代谢物，这在人类生物监测和暴露评估框架中具有重要意义，尤其对于经常使用农药产品的农场工人。通过采用SPE和LC-MS/MS等稳健技术，结合色谱、质谱和萃取条件的特定优化以及参数的准确验证，实现了对实际样本的灵敏分析。该方法在灵敏的检出限和定量限方面表现出对高通量样本分析的适应性。对摩洛哥农场工人样本的分析证明了该方法能够测量广泛浓度范围，表明其可用于评估如农田等复杂职业环境中个体的暴露，并促进其推广用于室内环境中一般人群的暴露评估。
