胚胎和出生后巨噬细胞对于牙齿正常发育和稳态是必需的

《Nature Communications》：Embryonic and postnatal macrophages are necessary for proper tooth development and homeostasis

　　

摘要：巨噬细胞在牙齿中的作用，除了其先天免疫功能外，仍未被探索。本研究证明，巨噬细胞在早期发育期间定植于牙组织，并在出生后预萌出阶段数量增加。在持续生长的牙齿中，巨噬细胞一生都与上皮和间充质干细胞龛（stem cell niche）相关联。为了研究它们在发育中的作用，研究人员利用神经嵴特异性（neural-crest specific）Wnt1Cre/Csf1^fl/fl和全身性Csf1R敲除（Csf1R knockout, Csf1R KO）小鼠模型，通过遗传学手段破坏巨噬细胞迁移。这导致牙本质（dentin）和牙釉质（enamel）沉积异常、萌出缺陷、早期牙齿模式错误以及成骨（osteogenesis）受损。值得注意的是，该表型通过骨髓移植（bone marrow transplantation, BMT）得到部分挽救。此外，在野生型成年小鼠中短期药理学耗竭巨噬细胞，会导致持续生长牙齿根尖部分的牙本质和牙釉质显著崩解，而这种崩解在停用氯膦酸盐（clodronate）后得以恢复。治疗后，巨噬细胞迅速重新定植于牙组织，并且通过单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq, scRNA-seq）分析观察到M2修复状态表型（M2 reparative state phenotype）的存在。总体而言，研究人员的发现揭示了巨噬细胞在牙齿发育以及间充质和上皮牙区室（tooth compartments）模式形成中的关键作用。这种先前未被认识的巨噬细胞在牙齿中的功能，类似于它们在复杂组织再生中的作用，需要未来研究来解析精确的细胞和分子机制。

**论文解读：巨噬细胞在牙齿发育与稳态中的关键作用**

**研究背景与问题**

牙齿是高度矿化的器官，其发育过程涉及上皮与间充质之间的精密相互作用，并依赖于干细胞龛的持续活动（尤其在持续生长的啮齿类门齿中）。巨噬细胞传统上被视为先天免疫系统的第一道防线，但近年来在肠道、肌肉、乳腺等器官中，它们被发现对维持干细胞龛稳态、组织形态发生和再生至关重要。然而，巨噬细胞在牙齿发育中的作用——尤其是在非炎症条件下——几乎完全未被探索。目前存在的主要问题包括：牙齿发育过程中巨噬细胞何时、如何定植？它们是否影响牙本质、牙釉质的形成以及牙齿萌出？巨噬细胞与牙上皮干细胞龛之间是否存在功能性相互作用？为了回答这些问题，研究人员开展了本研究。

**研究内容与结论**

研究人员利用小鼠模型，通过遗传学（Wnt1Cre/Csf1^fl/fl条件性敲除和Csf1r全身敲除）和药理学（氯膦酸盐脂质体Clodrosome?）手段耗竭巨噬细胞，并结合骨髓移植挽救实验、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、免疫组化、显微CT（microCT）等多种技术，系统揭示了巨噬细胞在牙齿发育、模式形成和稳态维持中的不可或缺的作用。研究发现，巨噬细胞在胚胎早期（E12.5）即定植于牙间充质，出生后预萌出阶段数量急剧增加，并与持续生长门齿的上皮干细胞龛（唇侧颈环labial cervical loop, LaCL）保持密切联系。遗传性巨噬细胞耗竭导致严重的牙齿发育缺陷，包括牙本质和牙釉质沉积异常、门齿钩状变形、多生牙出现、萌出延迟以及骨重塑障碍；而骨髓移植可部分挽救这些表型。药理学短期耗竭成年小鼠的巨噬细胞，则导致门齿根尖部牙本质和牙釉质的可逆性崩解，停药后巨噬细胞迅速恢复，并通过scRNA-seq检测到M2修复表型巨噬细胞的富集。该研究的重要意义在于首次揭示了巨噬细胞在牙齿发育和稳态中的核心调控作用，为理解组织再生和干细胞龛调控提供了新视角，并为牙齿发育异常相关疾病（如萌出失败、牙髓石症）的潜在治疗靶点提供了理论基础。论文发表在《Nature Communications》。

**主要关键技术方法**

1. **遗传学巨噬细胞耗竭模型**：利用神经嵴特异性Wnt1-Cre与Csf1^fl/fl小鼠杂交（Wnt1Cre/Csf1^fl/fl），以及全身性Csf1r敲除（Csf1r KO）小鼠，分别实现条件性和全身性巨噬细胞缺失。
2. **骨髓移植挽救实验**：将健康小鼠（C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)）的GFP+全骨髓通过腹腔注射移植到P1天的Csf1r KO小鼠体内，评估巨噬细胞重建对牙齿表型的挽救效果。
3. **药理学巨噬细胞耗竭**：对成年CD1野生型小鼠腹腔注射氯膦酸盐脂质体（Clodrosome?），通过不同给药方案（急性、恢复、长期）实现巨噬细胞的可逆性耗竭。
4. **单细胞RNA测序（scRNA-seq）**：对氯膦酸盐处理和未处理的小鼠门齿组织进行10x Genomics单细胞转录组测序，分析细胞组成变化及巨噬细胞表型转变。
5. **细胞间通讯分析**：利用CellChat工具，基于已发表的scRNA-seq数据推断巨噬细胞与牙上皮、牙髓等细胞簇之间的配体-受体相互作用。
6. **显微CT（microCT）**：对小鼠下颌骨进行高分辨率扫描，定量评估牙齿形态、骨厚度及萌出距离。
7. **组织学与免疫组化**：使用AIF1（IBA1）、F4/80、CTSK、CD44等标志物进行免疫荧光和免疫组化染色，结合RNAscope原位杂交检测Csf1、Csf1r、Sp7等基因表达。
8. **流式细胞术**：从门齿牙髓中分离细胞，分析F4/80+巨噬细胞和Gr-1+粒细胞的比例变化。
9. **细胞因子检测**：使用Proteome Profiler小鼠细胞因子阵列试剂盒分析牙髓中促炎和抗炎细胞因子水平。

**研究结果**

**1. 巨噬细胞在胚胎早期定植于发育中的牙齿，并在出生后萌出前阶段扩增**
通过AIF1免疫组化染色，研究人员在E12.5（胚胎第12.5天）的致密牙间充质中检测到巨噬细胞；随后在E15.5、E17.5及出生后P0-P14阶段，牙乳头/牙髓中的巨噬细胞数量显著增加（从约0.75-2%增至9.5-13%）。巨噬细胞广泛分布于牙髓、牙囊、牙槽隐窝上壁以及持续生长门齿的唇侧颈环（LaCL）区域，并与神经血管束、成牙本质细胞层等结构相关联。部分巨噬细胞在牙髓内增殖（AIF1/mKI67共定位）。

**2. 巨噬细胞与其他细胞类型及干细胞龛存在细胞和分子相互作用**
基于scRNA-seq数据的CellChat分析显示，巨噬细胞与牙囊、星网状层（SR）、中间层（SI）和外釉上皮（OEE）等存在25-50个相互作用对。特别发现Lgals9-CD44配体-受体对在巨噬细胞与牙上皮之间具有高通信概率。免疫组化验证了CD44在唇侧颈环的星网状层和中间层表达，且巨噬细胞与FosCreERT2谱系示踪的瞬时上皮祖细胞直接接触，提示巨噬细胞可能参与上皮干细胞龛的稳态调节。

**3. 神经嵴衍生物特异性Csf1基因破坏导致严重先天性牙齿缺损**
Wnt1Cre/Csf1^fl/fl小鼠中，AIF1+巨噬细胞在门齿和磨牙中几乎完全缺失。microCT显示门齿形态异常（缩短、钩状、不对称生长）、牙髓腔缩小、牙本质和牙釉质局部缺陷，甚至出现一例多生牙。组织学分析发现唇侧颈环形态异常、上皮层断裂、血管化增加。磨牙表现较轻，但萌出延迟。骨壁厚度分析显示下颌牙槽骨增厚，提示骨吸收受损。

**4. Wnt1Cre/Csf1^fl/fl小鼠表现萌出延迟、根伸长延迟和牙槽骨吸收相关缺陷**
在Wnt1Cre/Csf1^fl/fl小鼠中，磨牙萌出距离和根长显著减少。定量分析显示AIF1+细胞（巨噬细胞）减少，但CTSK+（破骨细胞）和AIF1+/CTSK+（前破骨细胞）细胞数量在突变体与野生型之间无显著差异。然而，在门齿牙槽骨中，突变体前破骨细胞（AIF1+/CTSK+）增加而成熟破骨细胞（CTSK+）减少，牙囊间隙增宽，表明CSF1信号对破骨细胞正确分化至关重要。

**5. 骨髓移植部分挽救Csf1r敲除小鼠的牙齿表型**
Csf1r KO小鼠（2周龄）牙齿中完全缺失AIF1+巨噬细胞，表型类似Wnt1Cre/Csf1^fl/fl小鼠（门齿钩状、磨牙牙尖扁平、萌出延迟）。通过P1天腹腔注射GFP+健康骨髓进行移植，2周后检测到牙髓中出现AIF1+/GFP+嵌合细胞（52.15±4.13个/ROI）。microCT分析显示，BMT后门齿和磨牙萌出有所改善，下颌骨和上颌骨厚度部分恢复，第一磨牙长度显著增加，但下颌骨总长度无显著变化。

**6. 药理学耗竭成年小鼠巨噬细胞导致持续生长牙齿中牙本质和牙釉质的可逆性破坏**
对成年小鼠腹腔注射Clodrosome?，急性处理（3天）后牙髓中F4/80+巨噬细胞比例从15.23%降至4.97%，恢复1周后回升至17.5%。免疫组化显示AIF1+细胞在牙髓和上皮区室均减少，同时观察到唇侧颈环形态异常和前成牙本质细胞/前成釉细胞过早分化。长期给药后，microCT和HE染色显示门齿根尖约1.5 mm处出现牙本质和牙釉质暂时性崩解，成牙本质细胞和成釉细胞层不连续。停药后，组织形态完全恢复。TRAP染色未在损伤部位检测到破骨细胞活性，排除了破骨细胞介导的二次损伤。细胞因子阵列和scRNA-seq均显示急性处理后促炎和抗炎因子下调。

**7. 单细胞RNA测序揭示氯膦酸盐处理后巨噬细胞表型转变为M2样修复状态**
对氯膦酸盐处理组和对照组门齿组织进行scRNA-seq分析，发现处理组出现一个Dspp+、Phex+的成牙本质细胞样细胞簇。更重要的是，巨噬细胞簇从M0样（静息）状态转变为M2样（修复）状态，表现为Stab1、C1qa等M2标志基因上调，而Cxcl2、Ccl4等M1标志基因下调，表明巨噬细胞快速响应组织损伤并启动修复程序。

**讨论与结论**

**总结讨论部分**：本研究揭示了巨噬细胞在牙齿发育、模式形成和稳态中的关键作用，扩展了其传统免疫防御功能的认识。巨噬细胞从胚胎早期（E12.5）即定植于牙间充质，出生后数量激增，并终生与上皮和间充质干细胞龛相关联。通过遗传学（Wnt1Cre/Csf1^fl/fl和Csf1r KO）和药理学（氯膦酸盐）耗竭实验，结合骨髓移植挽救和单细胞测序，研究人员证明巨噬细胞缺失导致牙本质和牙釉质沉积异常、萌出缺陷、早期牙齿模式错误（如多生牙）以及骨重塑障碍。药理学耗竭后的可逆性表型，以及M2修复表型巨噬细胞的快速出现，表明巨噬细胞在维持牙齿稳态和损伤修复中发挥核心作用。该研究还发现巨噬细胞可能通过Lgals9-CD44轴与牙上皮干细胞龛通讯。尽管部分表型（如萌出延迟）不能完全排除骨依赖效应，但整体证据支持巨噬细胞在牙齿发育中的自主性作用。这一发现与巨噬细胞在复杂组织再生（如蝾螈肢体再生）中的功能相似，提示其可能成为牙齿发育异常相关疾病的治疗靶点。

**研究结论部分翻译**：总体而言，研究人员利用多种方法靶向巨噬细胞——包括CSF信号通路的遗传操作（影响Csf1和Csf1r）、表型挽救实验和药理学耗竭——均得到相似的牙齿表现。研究结果突出了巨噬细胞在牙齿发育和稳态中发挥的关键作用。然而，巨噬细胞精细化形态发生的精确机制仍然未知，有待未来研究探讨。