重复神经元激活通过核重编程调控细胞成熟状态

《Nature Communications》：Repetitive neuronal activation regulates cellular maturation state via nuclear reprogramming

　　

神经刺激如电惊厥治疗（electroconvulsive therapy, ECT）和重复经颅磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation, rTMS）是治疗抑郁症和精神分裂症等广泛精神疾病谱的高效临床干预手段，然而其在细胞水平的作用机制仍知之甚少。研究人员通过在小鼠齿状回（dentate gyrus, DG）中采用重复光遗传神经元刺激模拟ECT，观察到与ECT相关的行为变化，包括抑郁样行为减少和运动活动增加。在细胞水平上，研究人员鉴定出一种向长期稳定状态的去成熟（dematuration），该状态持续超过一个月，其特征为核结构改变、类似于细胞周期G2/M期的基因表达模式以及导航信息的神经编码改变。此外，G2/M期主调节因子Cyclin B的敲除减弱了部分行为和细胞效应。这些发现表明慢性重复脑刺激触发了细胞状态的可塑性，揭示了一种刺激调控的核重编程形式，具有潜在的临床效用。

该研究发表于《Nature Communications》。目前成人哺乳动物大脑中高强度神经活动的细胞效应存在矛盾：一方面高振幅频率时长的累积电活动会导致兴奋性毒性（excitotoxicity）、代谢衰竭、树突棘丢失及细胞死亡；另一方面适度电活动对神经环路功能有益，如ECT、rTMS等脑刺激技术能改善重度抑郁症等症状并促进神经可塑性，但其具体细胞机制不明。已有研究提示神经元过度激活后出现衰老中间态即去成熟表型，且抗抑郁药如氟西汀（fluoxetine）也能诱导海马神经元去成熟，但重复脑刺激如何引发这种细胞状态改变的机理尚未阐明。因此研究人员开展本研究，旨在明确ECT类等脑刺激技术引发细胞去成熟的原发细胞机制，通过在体光遗传刺激模拟ECT，探究重复神经元激活对海马DG颗粒细胞成熟状态、基因组结构及行为的影响，并解析其分子通路。

研究人员主要采用以下关键技术方法：使用POMC-Cre::ChR2-EYFP小鼠在DG颗粒细胞表达通道视紫红质2（channelrhodopsin-2, ChR2）进行重复光遗传刺激（REPOPS）；结合集成光流探针实现同步给药与刺激；通过RNA测序（RNA-seq）和转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）分析转录组与染色质可及性；利用免疫荧光染色检测Calbindin、Cyclin B、Lamin B1、磷酸化组蛋白H3（phospho-histone H3, pH3）等标记物；采用在体钙成像（Ca²⁺ imaging）结合微型显微镜记录自由活动小鼠DG神经元活动；运用CRISPR-Cas9介导的Ccnb1/Ccnb2双敲除（CyclinB-KO）及药理学抑制剂（Ca²⁺阻断剂、激酶抑制剂、Wee1抑制剂PD-407824、Cdc25c抑制剂BN82002）干预；使用开放场（open field, OF）、悬尾（tail suspension test）、强迫游泳（forced swim test）、新奇抑制摄食（novelty-suppressed feeding test）等行为学测试；重新分析人死后DG的RNA-seq数据（双相障碍与重度抑郁症伴或不伴ECT治疗，SRP241159）及人海马发育数据集（GSE25219）作为人类样本队列对照。

Neuronal activation triggers an immature cellular state in DG granule cells

研究人员对POMC-Cre::ChR2-EYFP小鼠DG进行3天或10天REPOPS（10 ms脉冲，10 Hz，5 min/天）。结果显示3天REPOPS后24 h成熟标志物Calbindin（CB）表达降低但2周恢复；10天REPOPS后CB显著降低且持续2周以上。Ca²⁺阻断剂可抑制CB降低，表明Ca²⁺内流至关重要。RNA-seq显示10天REPOPS诱导的长期差异表达基因与正常幼鼠DG发育基因显著重叠（Overlap P=3.9×10^?52），呈不成熟样转录谱；3天刺激的变化则短暂可逆。重新分析人ECT治疗患者DG数据同样显示与海马发育过程的基因表达重叠（Overlap P=1.2×10^?8），突触相关基因GRIA1、GRIA2、ARC表达改变与小鼠REPOPS一致，证实ECT在人DG也诱导不成熟样基因表达模式。

Ca2? influx and subsequent kinase activation are indispensable for inducing a cellular immature-like state

研究人员通过集成光流探针在REPOPS同时灌注Ca²⁺阻断剂（NBQX、AP5、mibefradil、nimodipine），发现阻断Ca²⁺内流完全抑制REPOPS诱导的CB减少。使用激酶抑制剂（K252a、SB218078、Dasatinib、Ro-32-0432）发现K252a、SB218078、Ro-32-0432抑制CB降低而Dasatinib无作用。比对抑制剂谱筛选出57种候选激酶，包括调控组蛋白磷酸化的RSK/MSK及细胞周期关键调节因子CDK（cyclin-dependent kinases），表明Ca²⁺依赖性信号与磷酸化级联反应在去成熟中起核心作用。

REPOPS regulates the long-term plasticity of genomic structure

研究人员对刺激后DG进行ATAC-seq。3天REPOPS+2周组仅806个染色质区域可及性改变，而10天REPOPS+2周组达21853个（15098开放，6755关闭），表明10天重复激活引起三维基因组结构的广泛持久重组，伴随全局转录组变化，而短期刺激无此效应。

REPOPS initiates long-term anti-depressive behavioral changes in mice

研究人员进行行为学测试。10天REPOPS组在刺激后2周开放场前15 min移动距离仍显著高于无刺激组（P=0.00362），家笼24 h活动监测显示其活动逐渐增加并持续超1个月；3天组无持久改变。悬尾测试中10天组不动时间显著少于无刺激组和3天组（P=0.0094），强迫游泳类似；新奇抑制摄食测试10天组取食潜伏期更短（χ²=11.86, P=0.0027），且ANCOVA校正活动量后刺激组别效应仍显著（P=0.0045）；蔗糖偏好无差异。表明10天REPOPS降低抑郁样和焦虑相关行为但不影响快感缺失样行为。

Alterations of neural coding of navigational information

研究人员在体Ca²⁺成像结合REPOPS记录DG神经元。10天组整体Ca²⁺瞬变率无变，但空间信息编码减少（位置解码误差大于无刺激组，Days 2–11 P=0.0133，Days 24–26 P=0.0335），速度信息与速度细胞比例增加（速度解码精度更高，Days 2–11 P=0.0363，Days 24–26 P=0.0223）。表明重复激活重塑DG信息加工：抑制空间地图形成、增强速度相关活动，可能介导活动增加与抗抑郁行为。

REPOPS-driven long-term increases in the expression of cell-cycle-related genes

研究人员对RNA-seq做GO分析。10天REPOPS+2周组显著富集“细胞分裂”“有丝分裂细胞周期过程”等条目，G₂/M期基因Ccna2、Ccnb1、Ccnb2、Cdc25c上调，G₁、G₁-S期基因无变。免疫染色显示Cyclin B在10天+2周组DG神经元广泛表达而非仅亚颗粒区。比对HeLa细胞周期参考数据集（GSE3497）计算相似得分，10天+2周组在G₂/M对应时间点（7–8、20 h从S期起）得分>3.0，3天+2周组降至<2.0，表明重复激活使成熟神经元重启G₂/M期样转录程序并持久维持。

Long-term G₂/M phase-like epigenomic plasticity in nuclear structure

研究人员检测G₂/M特征核结构。（i）核纤层：无刺激组Lamin B1呈圆形完整，10天+2周组表达降低且结构破坏（P=0.016，圆度P=0.048）；（ii）有丝分裂标记：磷酸化组蛋白H3（pH3）在10天+2周组显著增加（P=0.015）；（iii）异染色质凝缩：Hoechst染色显示染色中心（chromocenter）比率显著增加（P=0.021）。三者变化重叠于颗粒细胞层，表明REPOPS诱导G₂/M样核状态（核纤层破坏、pH3增加、染色中心扩大），与RSK/MSK及CDK介导的染色质重塑一致。

Cyclin B mediates REPOPS-induced changes in nuclear structure, cellular immaturity, and behavior

研究人员在DG注射AAV9-SpCas9与sgRNA靶向Ccnb1/Ccnb2（CyclinB-KO）或 scramble（Scram-KO）。REPOPS在Scram-KO组引起的Lamin B1降低、pH3升高、染色中心比增加、CB减少及2周后活动增加，在CyclinB-KO组均被显著减弱（Lamin B1 P=0.039，pH3 P=1.2×10^?7，染色中心P=0.035，CB P=1.3×10^?4，活动Day24 P>0.99）。证明Cyclin B是连接重复神经元激活与G₂/M样核重塑、神经元不成熟及持久高活动的关键介质。

ΔFosB is upregulated by Cyclin B/Cdk1 activity and mediates persistent genomic remodeling

研究人员分析ATAC-seq motif富集发现开放峰类似AP-1转录因子（Fos/Jun家族）。ΔFosB（截断型FosB亚型，半衰期~208 h）在3天REPOPS后24 h短暂升高，40天回落；10天REPOPS后24 h升高且14、40天仍高。CyclinB-KO消除2周时的ΔFosB持续升高（P=5.1×10^?11），但不影响急性诱导。药理学调控Cyclin B/Cdk1：Wee1抑制剂PD-407824使3天REPOPS后2周ΔFosB升高、CB降低；Cdc25c抑制剂BN82002使10天REPOPS后ΔFosB升高被抑制、CB下降逆转。表明Cyclin B/Cdk1活性对ΔFosB持久上调及伴随的基因组重塑至关重要。

讨论部分总结：研究人员提出脑刺激如ECT和rTMS可能通过将细胞状态重编程为不稳定但稳定的未成熟构型实现疗效。REPOPS诱导G₂/M期样转录特征与核结构可塑性定义未成熟样状态，包括Cyclin A2、B1、B2、Cdc25c上调及核纤层破坏、pH3增加、染色中心扩大；该状态在疾病（阿尔茨海默病、颞叶癫痫、精神分裂症风险位点含M期基因）常为凋亡前异常细胞周期重入，但REPOPS未致显著细胞死亡，仅为部分G₂/M程序激活而非真正有丝分裂。ΔFosB因其长半衰期介导持久基因组重组与神经元去成熟，Ca²⁺内流启动此过程。行为上REPOPS增加DG速度细胞与速度编码解释活动增加与抗抑郁，但损害空间地图与远程记忆类似ECT遗忘副作用，突触基因长期下调（Gria1、Gria2、Camk2a、Camk2b、Arc）可能干扰空间信息编码。该未成熟状态具双稳态：适度重复刺激（ECT/REPOPS）为可逆治疗中间态；病理高兴奋（癫痫、阿尔茨海默病）则巩固为不可逆病变。取决于兴奋强度、重复次数与时机。研究人员提出工作模型：精神疾患可能为代谢/突触僵化能量极小值的神经元群，重复脑刺激触发模式化Ca²⁺内流驱动细胞去成熟，暂时重置代谢与突触稳态以恢复环路灵活性产生抗抑郁等行为效应；过度激活则恶化功能障碍。未成熟样状态可作为中等电刺激下细胞健康的双稳开关或高水平下疾病进展的开关，为人工神经刺激重编程脑健康提供新途径。

研究结论翻译：在本研究中，研究人员验证了脑刺激方法如电惊厥治疗（ECT）和重复经颅磁刺激（rTMS）可能通过将细胞状态重编程为未成熟但稳定的构型来实现有益临床效应的假设。研究人员开发了光遗传刺激即重复光遗传刺激（REPetitive OPtogenetic Stimulation, REPOPS），可重复诱导以细胞和三维基因组结构的全局转录组变化为指标的去成熟。这些变化在连续3天REPOPS后多为短暂，但在连续10天激活后可持续超1个月，与ECT的6–12次刺激方案一致。人DG的RNA-seq数据也显示ECT诱导患者不成熟样基因表达模式，类似REPOPS效应。REPOPS支撑的临床相关行为效应下，刺激方案诱导类似G₂/M期的细胞周期重入与核结构。这些改变被G₂/M转换主调节因子Cyclin B敲除所逆转。研究人员进一步发现Cyclin B/Cdk1激活稳定ΔFosB表达，从而促进基因组结构的持久重组。结果确立了支撑ECT有益临床效应的候选细胞机制，并为脑刺激疗法开发提供细胞视角。