《Nature Communications》：Diversity and distinctive characteristics of the global RNA virome in urban and peri-urban environments
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RNA病毒（RNA viruses）是人类关联环境及人类健康不可或缺的组成部分。然而，环境RNA病毒的生态学在很大程度上仍未被探索。在此，研究人员分析了从31个国家102个城市的城市及周边环境（包括人口密集场所，如交通枢纽、医院、银行，以及城郊环境）收集的29
RNA病毒（RNA viruses）是人类关联环境及人类健康不可或缺的组成部分。然而，环境RNA病毒的生态学在很大程度上仍未被探索。在此，研究人员分析了从31个国家102个城市的城市及周边环境（包括人口密集场所，如交通枢纽、医院、银行，以及城郊环境）收集的2922份宏转录组（metatranscriptomic）样本，构建了包含54945个RNA病毒的《城市与城郊RNA病毒图谱》（Urban & Peri-urban RNA Virus Atlas, UPVAtlas），其中77%此前未被观测到。基于UPVAtlas中RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerases, RdRPs）的系统发育重建极大地拓展了RNA病毒的进化多样性，导致识别出两个潜在的候选门（candidate phyla）、一个候选纲（candidate class）及数个未分类分支（unclassified clades）。宿主关联分析进一步揭示了环境RNA病毒的生态复杂性，其中脊椎动物相关及ESKAPE病原体相关病毒的多样性强调了持续监测城市环境以追踪RNA病毒流行率与动态变化的重要性，这对未来公共卫生具有直接相关性。
研究背景与意义
RNA病毒（RNA viruses）作为地球上进化最多样且生态分布最广的生物实体之一，因其固有的高突变率及作为新兴人类病原体主要来源的特性，长期以来备受关注。然而，庞大的病毒“暗物质”（viral dark matter）在全球生态系统尤其是快速扩张的城市环境中仍未得到充分表征。自新石器时代革命以来，城市化趋势持续上升，全球56.2%的人口居住在城市中，高密度人口与互联的交通网络使城市成为疫情传播的枢纽。尽管COVID-19大流行凸显了城市在公共卫生危机中的脆弱性，过去一个世纪对城市环境中RNA病毒分布的认识仍存在巨大知识缺口。城市环境可能是新型RNA病毒的未知储库，其持久性、传播与多样化对公共卫生、城市规划及可持续性构成广泛影响。因此，开展大规模城市微生物组调查以传达疫情早期预警并完善“智慧城市”构想显得尤为迫切。
本研究由研究人员发表于《Nature Communications》。研究人员通过分析全球31个国家102个城市的2922份宏转录组（metatranscriptomic）样本，构建了迄今为止最大的城市与城郊RNA病毒图谱（Urban & Peri-urban RNA Virus Atlas, UPVAtlas），包含54945个RNA病毒操作分类单元（RNA viral operational taxonomic units, RvOTUs），其中77%为前所未见的新病毒。研究极大拓展了Orthornavirae界（kingdom）的系统发育多样性，识别出两个潜在候选门及一个Kitrinoviricota内的新纲，揭示了RNA病毒在城市与自然生境中的生物地理分布模式、定向选择（directional selection）压力及宿主谱（host spectrum），特别是与ESKAPE病原体及脊椎动物相关的病毒多样性，为公共卫生监测及抗病毒治疗策略开发提供了重要见解。
主要关键技术方法
研究人员整合了MetaSUB联盟于2020年3月至7月采集的1862份全球城市宏转录组样本，并从序列读取档案（Sequence Read Archive, SRA）数据库筛选了1059份城郊环境（土壤、水体、废水、绿地等）及部分市场食用动物相关样本，总计2922份覆盖31国102城的样本。关键技术流程包括：利用Trimmomatic进行质控，Bowtie2去除人基因组污染，MEGAHIT进行从头组装（de novo assembly）；采用geNomad识别假定病毒重叠群（contigs），基于90%平均核苷酸一致性（Average Nucleotide Identity, ANI）及90%比对分数（Alignment Fraction, AF）聚类定义RvOTUs；通过迭代BLAST及HMMER基于RdRP核心基序（motifs A-D）鉴定RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRP）序列并聚类获得RCR95集；利用FastTree基于RdRP核心域构建最大似然系统发育树；通过CRISPR spacer比对（IMG及UHGG数据库）和ICTV数据库相似性匹配推断宿主；应用FADE（FUBAR Approach to Directional Evolution）检测RdRP位点定向选择；利用非度量多维尺度分析（Nonmetric Multidimensional Scaling, NMDS）和相似性分析（Analysis of Similarities, ANOSIM）评估环境病毒群落差异。
研究结果
A genomic catalog of RNA viruses from diverse environments
研究人员从近3亿条重叠群中筛选出675322条假定病毒重叠群，其中241082条（35.7%）属于Orthornavirae界，最终获得54945个含RdRP核心域的RvOTUs。积累曲线表明除人工环境外，绝大多数样本类型的RNA病毒多样性远未饱和。与已知病毒库比对仅22.73%的RvOTUs存在已知序列，92.03%的RvOTU长度短于5 kb，但51%达到中等基因组完整性（>50%）。不同环境优势RvOTUs各异，但高人类活动人工环境（车站、商店、医院）间表现出显著共现性。
Two potential candidate phyla expand the phylogenetic diversity of RNA viruses
基于RCR95集（52914条代表序列，91.51%获geNomad门级注释），研究人员在25个无门级注释的簇中发现7个簇形成两个深分支 clade，命名为upv.p.001和upv.p.002候选门。upv.p.001与Clostridioides difficile等细菌CRISPR匹配暗示其为噬菌体（bacteriophage），基因组约13 kbp含14-15个ORFs，RdRP位于末端伴二十面体衣壳域；upv.p.002仅北美欧洲检出，约6 kbp含2-4个ORFs，某成员含胶原域（collagen domain）且与Bacillus clarus匹配。upv.p.001偏好废水土壤沉积，upv.p.002偏好草地。
Phylogenetic nature and diversity of established phyla
在确立的五门中，Kitrinoviricota内RCR95成员形成潜在候选纲k.c.c.01（源自主壤、动物等）；Negarnaviricota中27个成员拓展Yunchangviricetes分布；Lenarviricota中99个成员形成Miaviricetes新分支；Pisuviricota内Duplopiviricetes呈多系性（polyphyly），其双链分支pisu.u.c.1经正负链读数比（logFRratio）验证为双链RNA（dsRNA）性质；Duplornaviricota整体多系性获证实，部分分支聚于Pisuviricota及Kitrinoviricota旁，暗示dsRNA病毒多次独立起源。
Directional selection of RNA viruses
利用FADE在五门及两候选门RdRP中共检出104个具定向选择证据氨基酸位点。Lenarviricota占57位（54.8%），偏好天冬氨酸[D]和苯丙氨酸[F]；Negarnaviricota占30位，涉及疏水相互作用及二硫键稳定。特定位点如Lenarviricota位点76（F, W）、727（M）、728（Y）、917（F, N, Y）及Negarnaviricota位点211（F）、212（C, N）显示重复替换，反映环境生态位适应性进化。
Biogeographical distribution of RNA viruses across diverse environments
Kitrinoviricota和Duplornaviricota为多数国家样本优势门。α多样性显示沉积土最高，废水次之，城市人工环境（街道、车站）较低。NMDS及ANOSIM（R=0.561, p<0.001）显示环境间群落显著分化，人类影响大环境均质性高。核心病毒组（core-virome）显示城市建成环境以真菌植物细菌病毒为主（82%），非城市陆地以轮状病毒相关RvOTU为著，水生环境亦以真核病毒为主。土壤是环境间最大连接角色。SARS-CoV-2见于城市环境。
Host spectrum of UPVAtlas
仅33.54% RCR95获宿主注释，其中50.33%为噬菌体（细菌宿主），挑战RNA病毒主要靶向真核宿主认知。Lenarviricota关联细菌（69.41%），Kitrinoviricota关联植物（85.81%），Duplornaviricota关联真菌（90.05%），Pisuviricota含95.30%脊椎动物相关病毒（含60种高可能感染人病毒）。CRISPR比对获9466匹配（946 RCR95，423细菌28古菌宿主），166个病毒有ESKAPE病原体（金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等）感染史。UHGG比对揭示606 RCR95感染人肠道Clostridia及Bacteroidia。与小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）等相关脊椎动物病原家族系统发育显示超半数与已知病毒相似度<50%，其基因组结构经历ORF分离、移位及2A肽出现的三阶段演化，感染脊椎动物成员基因组显著短于非脊椎动物宿主（p=0.000416）。
讨论与结论总结
研究人员在讨论中指出，UPVAtlas含约77%未见病毒，高频RvOTUs跨环境普遍存在暗示跨传播风险与人感染隐患。基于RdRP系统发育修订RNA病毒谱系，确认upv.p.002与Neri et al. p.0002聚类相近，佐证Duplornaviricota多系性及dsRNA病毒多次独立起源。人类活动致城市环境病毒多样性降低具均质化效应，废水高多样性支持其监测价值。短重叠群受限源于生物学（如Lenarviricota紧凑基因组）与技术（测序深度、宏转录组竞争），未来需病毒样颗粒纯化及长读长测序完善。样本国别环境偏差（如法国全温室、波兰97.8%车站）限制直接比较，需均衡分层采样。
宿主分析颠覆RNA病毒主要靶真核之成见，半数以上为噬菌体（尤Lenarviricota 69.41%），upv.p.001靶向艰难梭菌（Clostridioides difficile）具调节病原菌潜力，ESKAPE相关Pisuviricota病毒为噬菌体治疗耐药菌提供基础。人肠道Clostridia及Bacteroidia感染病毒揭示病毒-微生物互作。定向选择位点全球分布受温控、气候偏移及人类活动（城市化、农业）塑造，北极高位或因取样偏差经国别归一化校正，未来需时序采样探选择扫除（selective sweeps）。
局限含宏转录组RT错误及嵌合体风险、完整基因组少限功能分析、选择分析混淆多样化选择等、仅1/3病毒获宿主注释且预测工具缺金标准、相对丰度聚合偏差及链极性转录效率差异。尽管如此，UPVAtlas为百城最大RNA病毒集合，拓展病原相关病毒系统发育及ESKAPE宿主病毒认知，强调城市监测必要性，为分子特征（molecular signatures）及疫苗开发、疫情预测管控贡献现代分子流行病学基石。
结论翻译：RNA病毒是人类与环境健康的主要影响因素，尤其在人口密度更高、交通网络更互联的城市环境中，其可促进疫情传播。研究人员分析了COVID-19大流行前、中、后31国102城多样环境的2922份宏转录组样本，揭示54945个RvOTUs构成广泛地理分布的UPVAtlas，约77%此前未报道。结果表明城市环境蕴藏丰富多样RNA病毒组，高低频RvOTU在自然与城市中并存且分布各异，多环境盛行RvOTU（尤人活动相关）暗示跨环境传播、适应性及人感染风险。基于RdRP系统发育识别两新门（其一近Neri et al. p.0002），佐证Duplornaviricota多系性及dsRNA多次独立起源，发现Duplornaviricota内两新亚门/纲分支及Duplopiviricetes内多系性。全球RNA病毒组景观显人类活动致互联环境病毒多样性降低。废水高多样性支持监测体系。候选门丰度虽低但有独特生态位。方法限高度分歧RdRP捕获，现五门主导或因方法所限，需先进方法揭“隐藏”病毒。UPVAtlas中92% RvOTU<5 kb需谨慎解读（兼顾Lenarviricota紧凑生物学及技术碎片）。样本偏差（法全温室、波97.8%车站）限跨国环境比较，未来需均衡设计。宿主分析示多数病毒宿细菌真菌植物，契合全健康（One-Health），社会经济发展与脊椎动物病毒丰度显著相关。CRISPR示人肠道Clostridia及Bacteroidia感染病毒及166个ESKAPE病原相关病毒（多Pisuviricota），为抗病毒疗法奠基。RdRP定向选择位点（如Lenarviricota 57位）为全球适应及致病性分子标志助公共卫生响应。局限含宏转录组伪影、完整基因组少、选择分析替代机制、宿主注释少及预测局限、相对丰度聚合与极性偏差。总之，UPVAtlas为迄今最大城市环境RNA病毒集合，洞察百城病毒多样分布宿主，病原相关病毒系统发育拓展及ESKAPE宿主病毒发现具公共卫生潜意，强调持续监测必要性。MetaSUB联盟数据结合公共库助建病毒分子特征及本地适应理解，助疫苗开发及传播追踪，贡献城市环境病毒进化动力学认知管理及疫情预测管控。
