丹参（Salvia miltiorrhiza Buge）–葛根（Pueraria lobata (Willd.) Ohwi）药对通过Nrf2/System xc-/GPX4轴抑制缺血再灌注损伤后的铁死亡

《Antioxidants》：Danshen (Salvia miltiorrhiza Buge)–Gegen (Pueraria lobata (Willd.) Ohwi) Herb Pair Inhibits Ferroptosis After Ischemia–Reperfusion Injury Involving the Nrf2/System xc-/GPX4 Axis

　　

背景：丹参–葛根是传统中医药中的经典药对，已被用于治疗心血管和脑血管疾病。缺血性脑卒中（IS）是一种常见的脑血管疾病；铁死亡是驱动IS进展的促成因素之一。本研究旨在确定潜在机制，并检验丹参–葛根（DG）提取物是否可通过抑制铁死亡来预防脑缺血再灌注损伤。方法：采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q-orbitrap MS）分析DG的全面组成特征。实验在大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）大鼠和氧糖剥夺/复氧（OGD/R）细胞中进行。研究人员通过检查大鼠存活率、梗死体积、行为评分和脑含水量，评估DG对IS的神经保护作用。随后，研究人员测试了大鼠和细胞中Fe²⁺以及脂质过氧化产物如活性氧（ROS）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、髓过氧化物酶（MPO）和4-羟基壬烯醛（4-HNE）的积累。此外，在体内和体外评估了核因子红细胞衍生2样2（Nrf2）、溶质载体家族7成员11（-xCT）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、环氧合酶-2（COX-2）、转铁蛋白受体1（TFR1）和长链脂肪酸辅酶A连接酶4（ACSL4）的表达。结果：通过UPLC-Q-orbitrap MS分析表征了DG的化学轮廓，成功鉴定出33种化学成分。DG显著减轻了脑组织的缺血损伤，减小了梗死体积，并改善了神经功能障碍。Fe²⁺和脂质过氧化产物的含量显著降低。此外，DG可恢复Nrf2、-xCT和GPX4的表达，同时抑制COX-2、TFR1和ACSL4，从而实现对铁死亡的抑制作用。结论：DG通过Nrf2/System xc-/GPX4轴的调控作用可能在减轻铁死亡和促进脑缺血损伤恢复中发挥关键作用。

缺血性脑卒中（ischemic stroke, IS）是全球第二大残疾和死亡原因，其治疗手段有限，主要依赖机械取栓和静脉溶栓，但受限于狭窄的治疗时间窗及多种禁忌症。铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡形式，在IS后脑缺血再灌注（ischemia–reperfusion, I/R）损伤中发挥关键作用，表现为Fe²⁺积累和脂质过氧化产物增多。丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）–葛根（Pueraria lobata (Willd.) Ohwi）是传统中医中用于治疗心血管和脑血管疾病的经典药对，但其在脑缺血中抑制铁死亡的神经保护机制尚未明确。本研究旨在探讨该药对提取物（DG）是否通过抑制铁死亡发挥神经保护作用，并阐明其分子机制，为IS治疗提供新策略。该研究发表于《Antioxidants》。

研究人员采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q-orbitrap MS）鉴定DG的化学成分，并在体内建立大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）大鼠模型（雄性Sprague Dawley大鼠，230±10 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司），在体外建立氧糖剥夺/复氧（OGD/R）损伤的HT22小鼠海马神经元细胞系。主要技术方法包括：普鲁士蓝染色检测铁沉积，透射电镜（TEM）观察线粒体超微结构，免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）检测蛋白定位，Western blot（WB）定量蛋白表达，以及流式细胞术结合BODIPY^TM 581/591 C11探针检测脂质活性氧（ROS）。此外，采用试剂盒检测Fe²⁺、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、GSH/GSSG比值、髓过氧化物酶（MPO）和4-羟基壬烯醛（4-HNE）等铁死亡相关指标。

3.1. DG化学成分鉴定：通过UPLC-Q-orbitrap MS分析，成功鉴定出DG提取物中33种化合物，以黄酮类为主，兼有酚酸、苷类和丹参酮类，包括葛根素、丹酚酸B、丹参酮IIA和丹参素等核心活性成分，明确了其化学物质基础。

3.2. 体内实验结果：3.2.1. DG减轻MCAO/R大鼠脑损伤和神经功能缺损：DG（100、200、400 mg/kg）显著提高大鼠存活率，降低脑含水量，减小梗死体积和半球肿胀，改善mNSS评分和贴纸去除时间，并剂量依赖性地降低血清促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平。3.2.2. DG对铁死亡的影响：普鲁士蓝染色显示DG减少缺血侧海马和皮层铁沉积；血清Fe²⁺、MDA、4-HNE和MPO水平显著降低，GSH水平回升；TEM观察显示DG改善线粒体外膜破裂和嵴损伤，恢复线粒体形态。3.2.3. DG通过Nrf2/System xc-/GPX4轴抑制铁死亡：IHC结果显示DG上调缺血半暗带中GPX4和Nrf2表达，下调ACSL4表达；WB显示DG上调-xCT表达，下调TFR1和COX-2表达，逆转模型组异常变化。

3.3. 体外实验结果：3.3.1. DG保护OGD/R损伤的HT22细胞：DG（3–300 μg/mL）提高细胞活力，降低LDH释放，改善细胞形态，并抑制IL-6、IL-1β和TNF-α升高。3.3.2. DG对铁死亡的影响：DG剂量依赖性地降低Fe²⁺和MDA水平，升高GSH和GSH/GSSG比值；TEM显示DG减轻线粒体缩短增厚和嵴损伤；BODIPY^TM 581/591 C11荧光和流式细胞术证实DG抑制脂质ROS积累；MPO和4-HNE水平降低。3.3.3. DG涉及Nrf2/System xc-/GPX4轴：IF显示DG恢复Nrf2荧光强度，而Nrf2抑制剂ML385逆转此效应；WB显示DG上调-xCT和GPX4表达，ML385可逆转；IF和WB还显示DG下调ACSL4、TFR1和COX-2表达。

讨论部分总结了铁死亡在脑I/R损伤中的关键作用，以及DG通过三个经典铁死亡调控通路（铁代谢、氨基酸代谢和脂质代谢）发挥抑制作用，其中Nrf2/System xc-/GPX4轴是核心调控级联。DG通过激活Nrf2信号恢复-xCT表达，保障GSH合成以维持GPX4功能，清除有毒脂质氢过氧化物，同时抑制TFR1介导的铁摄取和ACSL4/COX-2相关的脂质过氧化，从而阻断铁死亡。ML385实验进一步证实该通路依赖性。研究结论：DG通过抑制铁死亡对脑I/R损伤发挥神经保护作用，为缺血性脑卒中治疗提供新见解。