婴儿配方奶粉中多种美拉德反应产物对宿主免疫和神经毒性的影响

《Foods》：The Effects of Multiple Maillard Reaction Products in Infant Formula on Host Immunity and Neurotoxicity

　　

在婴儿配方奶粉的热加工和储存过程中会形成多种美拉德反应产物（Maillard reaction products, MRPs）。然而，安全性评估通常基于单个化合物，这可能无法充分反映真实食品中多种共存成分暴露相关的潜在风险。因此，本研究采用气相色谱-质谱联用（GC–MS）筛选婴儿配方奶粉中的典型MRPs。基于检测结果，研究人员选择乙二醛（glyoxal）、2-乙酰呋喃（2-acetylfuran）、2-糠醛（2-furfural）和5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural, 5-HMF）建立混合暴露体系。随后，以斑马鱼为模型，研究人员系统评估了两种混合物浓度（1/9最大非致死浓度（maximum non-lethal concentration, MNLC）和1/3 MNLC）对免疫系统、神经系统、胃肠道和肝脏的毒性效应。结果表明，这四种MRPs在婴儿配方奶粉中共存，且联合暴露即使在低剂量下也诱导显著的生物损伤。两种混合物浓度均显著降低了中性粒细胞和巨噬细胞水平，并促进了中枢神经系统细胞的凋亡。较高浓度混合物进一步降低了T细胞计数，抑制了运动神经元发育，并减少了光期运动活性。此外，较高浓度混合物减少了胃肠道面积，增加了肝脏面积，延迟了卵黄囊吸收，并造成了明显的组织病理学损伤。与单一化合物暴露相比，联合暴露在免疫和神经相关终点上产生了更显著的影响，表明不同MRPs之间存在协同相互作用，并确定免疫和神经系统是更敏感的毒性靶点。总之，婴儿配方奶粉中典型MRPs的混合暴露可能比基于单一成分评估所预测的生物风险更大。本研究为识别联合毒性以及改进热加工婴儿食品中MRPs的安全性风险评估提供了实验证据。

**论文解读：婴儿配方奶粉中多种美拉德反应产物对宿主免疫与神经毒性的联合效应研究**

**一、研究背景与问题提出**

美拉德反应（Maillard reaction）是食品热加工与储存过程中最常见的非酶褐变反应之一，涉及还原糖的羰基与蛋白质、肽或游离氨基酸的氨基反应，生成一系列中间产物和终产物，如Amadori产物、α-二羰基化合物、呋喃类化合物及晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products, AGEs）。该反应虽能赋予食品色泽、香气与风味，但也可能降低营养品质并产生潜在有害的低分子量产物。在乳制品、谷物基食品及婴儿食品中，由于反应底物丰富且常采用热加工工艺，美拉德反应及其产物尤其值得关注。婴儿配方奶粉富含蛋白质、脂肪和乳糖，且通常采用喷雾干燥法生产，这些特性可能促进美拉德反应并导致多种美拉德反应产物（Maillard reaction products, MRPs）的积累。已有研究表明，加工和储存过程中会形成多种热反应标志物，包括Amadori化合物、AGEs、α-二酮类及呋喃类化合物。其中，乙二醛（glyoxal）、2-糠醛（2-furfural）、2-乙酰呋喃（2-acetylfuran）和5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural, 5-HMF）尤为典型。乙二醛是一种高反应活性的α-二羰基化合物，是AGEs的关键前体，可引发蛋白质修饰、羰基应激和氧化损伤；5-HMF和糠醛衍生物是热加工中广泛生成的脱水与热解产物，过量暴露与宿主氧化应激、发育毒性和器官特异性损伤相关；2-糠醛在动物研究中主要靶向肝脏，反复暴露可诱导肝细胞空泡化、炎症和肿瘤相关变化；2-乙酰呋喃则因呋喃类调味物质可形成损伤DNA的反应性代谢物而被认为具有遗传毒性警示。

然而，当前多数研究聚焦于单个MRPs的形成机制、分析方法及特定毒性效应，但消费者在真实膳食条件下更可能同时暴露于多种MRPs。婴幼儿处于快速生长发育阶段，其免疫、神经和消化/代谢系统尚未完全成熟，对外源性化学暴露通常更为敏感。因此，基于实际食品暴露特征建立代表性MRPs混合物体系，并评估其多器官、多终点毒性，对于改进婴儿配方奶粉的安全性评估具有重要实践意义。本研究旨在通过检测婴儿配方奶粉中典型MRPs，构建混合暴露体系，利用斑马鱼模型系统评价其免疫、神经、胃肠及肝脏毒性，并比较混合物与单一化合物的毒性差异，以揭示MRPs之间是否存在协同效应。

**二、主要研究方法与技术**

本研究采用气相色谱-质谱联用（GC–MS）技术，对三种市售婴儿配方奶粉（主要成分包括牛乳、脱盐乳清粉、乳糖、植物油、OPO结构脂、维生素和矿物质，采用喷雾干燥工艺涉及160–180°C高温处理）中12种MRPs进行定性分析。基于检测结果，筛选出在至少两种奶粉中检出的四种典型MRPs（乙二醛、2-乙酰呋喃、2-糠醛和5-HMF），并根据每种化合物的最大非致死浓度（MNLC）设置两个混合暴露体系：Complex 1（1/9 MNLC）和Complex 2（1/3 MNLC）。以斑马鱼为模型生物，利用转基因品系（绿色荧光标记中性粒细胞、巨噬细胞，红色荧光标记T细胞，绿色荧光标记运动神经元）进行体内荧光成像，结合行为学分析（光暗周期运动距离与速度）、吖啶橙（acridine orange, AO）染色检测中枢神经细胞凋亡、解剖显微镜测量胃肠道面积与肝脏形态、苏木精-伊红（H&E）染色评估肝脏组织病理学变化。所有实验均设置正常对照组（NC）和溶剂对照组（1% DMSO），每组10个重复，数据以均值±标准差表示，采用非配对t检验进行统计分析。

**三、主要研究结果**

**3.1 婴儿配方奶粉中美拉德反应产物的鉴定**
通过GC–MS分析，12种MRPs的保留时间范围为2.110–14.372分钟。在三种奶粉样品中，2-乙酰呋喃、2-糠醛和5-HMF均被检出，乙二醛在两种样品中被检出，其余8种MRPs低于检测限。结果表明，婴儿配方奶粉中确实存在多种MRPs，且以乙二醛、2-乙酰呋喃、2-糠醛和5-HMF为主要共存化合物。

**3.2 混合物对斑马鱼免疫的影响**
利用转基因斑马鱼模型，研究人员评估了两种混合物浓度对中性粒细胞、巨噬细胞和T细胞的影响。与NC组相比，Complex 1和Complex 2均显著降低了中性粒细胞和巨噬细胞的荧光强度（p < 0.01），且Complex 2的中性粒细胞毒性显著强于Complex 1（p < 0.01）。T细胞仅在Complex 2组中显著降低，而Complex 1组无显著变化。这表明混合物免疫毒性呈浓度依赖性，且高浓度组对适应性免疫细胞也产生抑制。

**3.3 混合物对斑马鱼神经系统的影响**
斑马鱼运动行为分析显示，在光期（前5分钟和第二光期11–15分钟），Complex 1和Complex 2组的运动速度均显著低于NC组（p < 0.05或p < 0.01），但在暗期各组间无显著差异。中枢神经细胞凋亡分析表明，两种浓度混合物均显著增加凋亡荧光强度（p < 0.001），且Complex 2组高于Complex 1组（p < 0.01）。运动神经元长度仅在Complex 2组显著缩短（p < 0.05）。这些结果提示混合物诱导神经毒性，主要影响光期行为和中枢神经细胞存活。

**3.4 混合物对斑马鱼胃肠道的影响**
胃肠道面积测量显示，Complex 1组与NC组无显著差异，但Complex 2组胃肠道面积显著减少（p < 0.01）。单位面积胃肠道中性粒细胞数量在各组间无显著差异。表明高浓度混合物主要影响胃肠道形态发育，而非局部免疫细胞浸润。

**3.5 混合物对斑马鱼肝脏的影响**
肝脏形态分析显示，Complex 1组仅延迟卵黄囊吸收面积显著增加（p < 0.01）；Complex 2组肝脏面积和延迟卵黄囊吸收面积均显著增加（p < 0.01），但肝脏亮度无显著变化。H&E染色进一步显示，1/9 MNLC组出现局灶性肝细胞坏死、核增大和空泡变性；1/3 MNLC组除上述改变外，还出现细胞质水肿、淡染和坏死灶。表明混合物诱导肝毒性，主要表现为肝脏增大、卵黄囊吸收延迟及组织病理损伤。

**3.6 混合物与单一化合物毒性比较**
通过与前期单一化合物毒性数据对比，研究人员发现混合物在免疫和神经毒性方面表现出显著的协同增强效应：混合暴露对巨噬细胞和T细胞的抑制作用强于任何单一化合物，对中枢神经细胞凋亡的诱导作用也更为强烈。而在胃肠道和肝脏毒性方面，混合物的效应并未持续超过单一化合物。这表明协同效应具有器官特异性，免疫和神经系统是更敏感的靶点。

**四、讨论与结论**

讨论部分指出，婴儿配方奶粉中MRPs的共存特征表明，实际暴露为混合暴露而非单一化合物暴露。乙二醛等反应性羰基化合物可诱导蛋白质-核酸交联、氧化应激和炎症失调，而5-HMF和呋喃类化合物具有细胞毒性，联合暴露可能通过羰基应激和凋亡通路协同增强免疫抑制。在神经毒性方面，氧化应激被认为是共同机制，乙二醛作为AGEs前体可能通过蛋白质交联和线粒体应激放大神经元损伤。胃肠道毒性主要表现为发育毒性而非炎症反应，肝脏毒性则涉及代谢负担加重和组织损伤。与单一化合物相比，混合物的协同效应在免疫和神经系统中最突出，这可能与这两个系统的高能量需求、快速响应性及对氧化应激的敏感性有关。本研究有两个局限性：一是当前终点主要基于形态学和荧光分析，未来需纳入氧化应激、炎症和凋亡通路分子标志物；二是婴儿配方奶粉成分复杂，基质效应可能影响实际暴露风险，需进一步研究。

**结论**：基于婴儿配方奶粉中检测出的典型MRPs，本研究建立了由乙二醛、2-乙酰呋喃、2-糠醛和5-HMF组成的混合暴露体系。利用斑马鱼模型，研究人员系统评估了该混合物的发育性和多器官毒性。结果表明，婴儿配方奶粉中MRPs呈现明显的共暴露特征，其毒性效应无法仅通过单一化合物的加和效应完全预测。与单一化合物暴露相比，联合暴露在较低剂量下即诱导更显著的免疫抑制和神经毒性，表现为中性粒细胞、巨噬细胞和T细胞数量减少，神经元凋亡增加，运动神经元发育受损。此外，高剂量混合物还引起胃肠道发育异常、肝脏形态改变、卵黄囊吸收延迟及更严重的组织病理损伤。总之，本研究为改进食品中美拉德反应产物毒性的控制提供了理论依据。