综述：研究翻译抑制剂作用上下文特异性的方法

《International Journal of Molecular Sciences》：Approaches for Studying Context Specificity of Translation Inhibitor Action

　　

信使RNA（mRNA）的序列不仅决定了核糖体合成的蛋白质序列，还定义了该过程的效率。许多对细菌致命的抗生素通过靶向核糖体功能中心来抑制翻译的各个阶段。一些抗生素不仅对核糖体工作周期的特定阶段具有特异性，还对mRNA序列内的特定模式具有特异性。本综述涵盖了广泛的研究方法——包括体内和体外方法、低通量和高通量技术，如报道基因构建体、蛋白质合成抑制剂表征（ChIPS）、趾印法、冷冻电子显微镜（cryo-EM）、蛋白质标记，以及与下一代测序（NGS）相结合的方法，如核糖体图谱分析与后续NGS（Ribo-seq）、逆转趾印法结合NGS（iTP-seq）、高通量趾印法与NGS（Toe-seq）以及核糖体展示——用于研究翻译抑制剂的序列特异性，这是一个快速发展的分子生物学关键领域。研究人员呈现了各种方法，讨论了它们的应用，并进行了比较分析。本综述的基础研究价值在于为研究核糖体停滞机制的科学家建立标准化的实验选择指南，从而最小化试错成本。其应用相关性同样重要。该综述强调了其在辅助序列特异性小分子抑制剂的筛选和机制分析中的转化价值。此外，理解蛋白质生物合成抑制的机制及其对特定mRNA序列的依赖性，可能有助于开发能够精确抑制特定多肽合成的选择性试剂，例如来自病原菌的蛋白质或癌症相关蛋白。

论文主体部分内容总结如下：

**1. 引言**
翻译是由核糖体（ribosome）这一大分子核糖核蛋白复合体执行的蛋白质生物合成关键过程。该复合体解码mRNA序列中的遗传信息并将其翻译为蛋白质的氨基酸序列。核糖体与多种配体相互作用，包括mRNA、转移RNA（tRNA）和翻译因子。mRNA序列不仅决定蛋白质序列，还影响蛋白质生物合成的效率，其变化可达四个数量级。翻译也是多种抗生素的靶点，这些抗生素通过与核糖体功能中心结合并在不同阶段干扰蛋白质生物合成来抑制细胞生长或导致细胞死亡。最初，此类抑制剂被认为对蛋白质序列没有选择性，但越来越多的证据表明，一些抗生素以序列特异性方式发挥作用，选择性地阻断新生肽链中特定基序的翻译。Mankin小组首次证明大环内酯类抗生素在结合核糖体时允许选择性蛋白质合成，从而重塑细胞蛋白质组而不全局停止翻译。随后，Sergey Dmitriev等人利用真核细胞无细胞翻译系统和趾印法技术，证明植物生物碱哈林通碱（HT）及其衍生物特异性地使携带Lys、Arg、Tyr密码子的P位点核糖体停滞。随着时间的推移，通过低通量和高通量方法，越来越多的抗生素被证实具有上下文特异性抑制，包括氨基环戊醇类、氯霉素（CHL）、利奈唑胺（LZD）、天然酮内酯类等。这些数据表明，核糖体新生肽链出口通道（NPET）是一个动态环境，其中合成的肽链、核糖体和抑制剂以复杂的序列依赖性方式相互作用。理解这些相互作用可能为改变抗生素选择性和克服抗生素耐药性开辟新途径。此外，创建针对特定mRNA的选择性抑制剂是一个有前景的方向。本综述旨在详细概述用于识别核糖体停滞基序和验证各种翻译抑制剂序列特异性的多种方法，并系统分类所有体内和体外、低通量和高通量实验方法，进行横向比较分析，提出基于场景的实验选择策略和组合验证工作流程。

**2. 研究翻译抑制剂作用上下文特异性的多种方法**

**2.1. 研究翻译抑制剂作用上下文特异性的单mRNA方法**

**2.1.1. 体内方法：报道基因构建体与菌株**
一些翻译抑制剂（如大环内酯类、林可酰胺类、链阳菌素B组（MLS）抗生素和氯霉素）的自然传感器依赖于调控抗性基因表达的衰减系统，该系统通过核糖体在特定mRNA序列上的停滞来发挥作用。衰减系统调控多种基因的表达，包括负责MLS抗性的erm家族。最受研究的由抗生素诱导的衰减系统是金黄色葡萄球菌的ermCL-ermC操纵子。在无抑制剂时，Erm(C)L被有效翻译，而erm(C)的核糖体结合位点（RBS）被mRNA二级结构掩盖。抗生素诱导的Erm(C)L翻译停滞会重新配置mRNA二级结构，促进Erm(C)合成。这一自然机制启发人们通过将甲基转移酶基因替换为β-半乳糖苷酶（lacZ）报道基因来创建MLS抗生素传感器。此类报道基因可用于测试抗生素是否在特定序列处停滞核糖体。另一种表征蛋白质合成抑制剂的组合方法称为ChIPS，该方法包括体内阶段（使用工程化抗生素超敏大肠杆菌菌株快速分离耐药突变体）和体外阶段（通过趾印法监测药物诱导的核糖体停滞模式）。这些低通量方法适用于验证已知的停滞基序，但不适用于高通量筛查未知序列，且可能因mRNA二级结构干扰而产生假阳性信号。

**2.1.2. 体外方法：趾印法与冷冻电镜**
趾印法（toeprinting）被认为是测试翻译抑制剂在特定mRNA序列上引起核糖体停滞的金标准体外方法。该方法基于从mRNA下游引物进行的逆转录（RT），当逆转录酶遇到翻译中的核糖体时，会提前终止，产生与核糖体P位点距离16个核苷酸（nt）的互补DNA（cDNA）产物。通过比较全长cDNA和较短产物（翻译中间体）的条带强度，可推断翻译效率，并精确定位核糖体停滞或暂停位置。趾印法一次只能分析一个mRNA序列和一个抑制剂效应，用于测试多种抗生素，如MLS、BOR、CHL、恶唑烷酮类等。该方法也已适应真核细胞无细胞翻译系统。近年来，冷冻电子显微镜（cryo-EM）成为可视化生物分子和复合物三维（3D）结构的有力工具，可达到近原子分辨率。cryo-EM已广泛应用于核糖体详细结构研究，揭示其与tRNA、翻译因子、mRNA和各种配体的空间相互作用。cryo-EM研究证实了大环内酯类依赖的核糖体停滞，揭示了不同抗生素（如RZD、LZD、TcmX、EtaA、CHL）上下文特异性作用的结构基础。这些低通量方法不能同时分析整个mRNA文库，且cryo-EM需要耗时费力地获得高纯度的药物结合核糖体复合物。近年来，这些方法主要用于验证高通量方法获得的发现。

**2.2. 研究翻译抑制剂作用上下文特异性的高通量方法**

**2.2.1. 体内方法：蛋白质标记与Ribo-seq**
为监测活细胞中合成蛋白质的全局模式，可使用放射性（如[³⁵S]、[¹⁴C]）或非放射性（如HPG、OPP）标记。通过一维或二维聚丙烯酰胺凝胶电泳分析新合成的蛋白质，可比较对照和抗生素处理后的差异。该方法已用于分析正常大肠杆菌细胞及经各种抗生素处理后的从头合成蛋白质，证明即使在药物存在下，细胞仍能选择性合成特定蛋白质子集。这些蛋白质可通过质谱鉴定。下一代测序（NGS）技术的进步导致了体内核糖体图谱分析法（Ribo-seq）的发展。Ribo-seq揭示核糖体在活细胞mRNA上的分布：核糖体密度峰值出现在蛋白质生物合成减慢的密码子处。该方法基于分离核糖体保护的mRNA片段（RPFs），然后进行深度测序并映射到参考基因组。Ribo-seq具有单核苷酸分辨率，可评估各种条件（如抗生素）对mRNA翻译的影响。多个Ribo-seq实验已确定了大环内酯类（如AZI、ERY）优先抑制Arg/Lys-X-Arg/Lys（+X+）基序的翻译，并揭示了CHL和LZD的上下文特异性抑制（CHL优先在Ala密码子处停滞，LZD对Ala有更强偏好）。Ribo-seq也用于评估KSG、EVN、RET等抗生素的序列特异性抑制。然而，Ribo-seq存在实验方法学和数据分析中的伪影和挑战，如RNase的序列偏好和文库制备过程中的偏差。

**2.2.2. 体外方法：iTP-seq、Toe-seq和核糖体展示**
与Ribo-seq使用自然mRNA文库不同，合成文库随机化了大部分编码区，从而统一了其他mRNA片段。逆趾印法结合深度测序（iTP-seq）是一种体外高通量方法，利用高度过程性的外切核酸酶RNase R从mRNA 3'端降解，直到遇到前沿核糖体，从而保留停滞核糖体上游的完整编码区。iTP-seq已用于表征游离核糖体和药物结合核糖体（如ERY、Ole、TEL、TcmX）的停滞景观。最近开发的Toe-seq方法将经典体外趾印法与NGS结合，通过使用mRNA文库替代单个mRNA分子，可同时检测数千种合成mRNA上的核糖体停滞。Toe-seq已在多种抗生素（如CHL、ERY、TcmX、EtaA、BotA2、AZI及其衍生物）中成功应用，并首次揭示了EtaA和BotA2的停滞特异性。另一种体外方法是核糖体展示（ribosome display），用于高通量选择高效蛋白质或肽结合物。该方法通过将mRNA与翻译的肽链通过嘌呤霉素共价连接，形成稳定的mRNA-蛋白质复合物。在改进的核糖体展示方法中，用于鉴定小分子PF846存在下人类核糖体停滞的氨基酸序列。这些体外高通量方法允许在随机化编码区的mRNA文库中鉴定抑制剂诱导的核糖体停滞位点，但随机化不可避免地导致提前终止密码子，且文库制备步骤可能引入偏差。

**2.3. 识别核糖体停滞序列的额外方法**
除上述方法外，还有几种用于识别无抗生素条件下核糖体停滞序列的低通量和高通量方法。低通量整合体内外新生链分析（iNP）结合了平行体外和体内系统，通过检测新生多肽和肽基-tRNA来监测核糖体暂停和停滞。该方法利用肽基-tRNA在中性pH SDS-PAGE中迁移率较慢的特性，鉴定了大量翻译暂停位点。高通量遗传选择方法利用tmRNA介导的核糖体救援系统，将大肠杆菌细胞存活与特定核糖体停滞联系起来。通过将随机化肽序列与截短的卡那霉素抗性蛋白（KanR）融合，只有核糖体停滞才能招募工程化的tmRNA-K1完成KanR合成，赋予卡那霉素抗性。该方法鉴定出多种停滞肽，包括含有C端脯氨酸残基、SecM样序列和新型FXXYXIWPP基序的肽。STALL-seq（从大文库中筛选翻译停滞序列）结合了改进的mRNA展示测定法和深度测序。该方法利用嘌呤霉素在核糖体停滞时与新生肽链结合，形成稳定的mRNA-蛋白质复合物。STALL-seq在细菌和真核系统中均发现了富集的停滞基序，如细菌中的C端多脯氨酸基序和真核中的Pro-Pro或(K/R)XG(I/V)G基序。这些方法尚未被应用于研究抗生素序列特异性，但具有适应潜力。

**3. 比较分析与优化展望**

**3.1. 研究翻译抑制剂作用上下文特异性的方法比较分析**
这些方法在分子生物学中广泛应用，各有优缺点。体内方法在天然细胞条件下进行，使用自然mRNA或合成构建体，多样性受限于天然转录本数量和表达水平。体外方法则具有文库多样性高、条件可控的优点。低通量技术（如报道基因构建体、趾印法、cryo-EM）适用于验证高通量筛选结果，结果清晰、可重复、成本较低。高通量方法（如Ribo-seq、iTP-seq、Toe-seq）通常多阶段、成本高、时间长，但能提供广泛的mRNA多样性和高通量能力，适用于从头发现未知停滞基序。合成转录本的设计需考虑密码子组成以避免提前终止密码子，并限制文库大小以确保单个mRNA变体的充分覆盖。核糖体展示方法允许在每轮选择后引入随机突变，加速定向进化。所有大规模测序方法都需要先进的计算分析，并建议通过低通量方法验证结果。

**3.2. 主流高通量方法比较**
Ribo-seq、iTP-seq和Toe-seq是三种主流高通量平台。Ribo-seq在活细胞中分析自然mRNA文库，而iTP-seq和Toe-seq主要在体外纯化细菌系统中分析随机化编码区。Ribo-seq和iTP-seq面临序列特异性酶和文库制备偏差，Toe-seq仅文库制备存在问题。最准确的从头鉴定是通过三种技术或至少Ribo-seq与iTP-seq或Toe-seq之一获得一致序列。推荐的工作流程包括使用两种并行方法进行特定序列添加，以及设计预设组成的合成mRNA文库以最大化序列多样性。

**3.3. 额外方法的优化展望**
iNP、遗传选择和STALL-seq尚未被用于研究抗生素序列特异性，但可通过将抗生素选择性压力引入筛选系统来适应。需避免使用与嘌呤霉素、氯霉素或卡那霉素结合位点相同或相近的抑制剂，因为这些抗生素分别用于这些方法的样品处理。建议使用预设组成的合成mRNA文库，并采用TdT加尾和接头连接两种方法以减少偏差。

**3.4. 多技术联合验证策略**
对于多种翻译抑制剂，不同方法已获得一致结果。停滞基序可能非常严格（如CHL、LZD、BotA2），也可能多样且受偏好规则集支配（如大环内酯类、TcmX、EtaA）。建议的研究流程包括：首先进行体内和/或体外蛋白质标记以检测选择性蛋白质合成，并用经典趾印法进行初步检测；其次，如果观察到上下文特异性，应用高通量方法（Ribo-seq、iTP-seq或Toe-seq）；然后，通过低通量方法（趾印法、报道基因构建体）验证强停滞基序；接着，从细菌系统获得核糖体-抑制剂复合物的结构解析；之后，利用额外的大规模主流方法确认停滞基序；最后，在真核系统中应用高性能技术（如核糖体展示）并结合结构研究。这种多管齐下的方法确保了对抗生素诱导的翻译停滞的稳健和可靠表征。

**4. 结论**
早期低通量方法（如报道基因构建体、ChIPS、趾印法、cryo-EM）曾是研究翻译抑制剂上下文特异性的主要来源或提供了初步见解。随着高通量方法（如Ribo-seq、iTP-seq、Toe-seq、核糖体展示）的出现，这些低通量方法现在主要用于验证大规模研究的发现。所有方法对于确认翻译抑制剂的序列特异性仍然至关重要。抑制剂的性质和核糖体结合位点强烈影响其停滞模式谱。本综述的基础科学价值在于为研究核糖体停滞机制的科学家建立标准化的实验选择指南，其应用相关性在于理解蛋白质生物合成抑制机制及其对特定mRNA序列的依赖性，从而开发选择性药物。本综述提供了详细的方法概述、系统分类、比较分析以及实验选择策略和优化展望，指导未来翻译抑制剂的机制研究。