S100-A4蛋白（Mts1）的新功能：Mts1通过TREM-1受体刺激细胞毒性淋巴细胞的活化

《International Journal of Molecular Sciences》：A New Function of the S100-A4 Protein (Mts1): Mts1 Stimulates the Activation of Cytotoxic Lymphocytes via the TREM-1 Receptor

　　

寻找免疫应答的新调节因子是现代免疫学的重要任务。在本研究中，研究人员发现Mts1以高特异性与先天免疫受体TREM-1（triggering receptor expressed on myeloid cells）结合，并与之形成稳定复合物。在巨噬细胞表面也发现了该复合物。Mts1相互作用后条件培养基中可溶性sTREM-1（soluble TREM-1）的出现被视为受体激活的起始点。PCR分析表明，Mts1处理后促炎基因IL6（interleukin 6）、IL1β（interleukin 1 beta）和TNF（tumor necrosis factor）的转录被激活。基于这些结果，Mts1可被视为一种新的TREM-1配体。利用限制性胰蛋白酶水解，研究人员鉴定了Mts1中负责TREM-1激活的表位。与全长Mts1蛋白类似，Mts1蛋白的17个氨基酸残基的M7肽（⁴¹ELPSFLGKRTDEAAFQK⁵⁷）也能激活TREM-1受体。将人淋巴细胞与Mts1蛋白或其M7肽孵育，可导致能够通过凋亡或坏死性凋亡裂解HLA缺陷癌细胞的NK细胞和T淋巴细胞毒性亚群的出现。激活的淋巴细胞在HLA阴性肿瘤细胞中诱导凋亡和坏死性凋亡。这种新的调节肽可能潜在地用于炎症过程的调控和抗肿瘤免疫的激活。

**论文解读文章**

**研究背景、存在问题及研究目的**
炎症反应在免疫应答中发挥核心作用，但慢性炎症也参与多种疾病的发生发展。TREM-1（triggering receptor expressed on myeloid cells）是一种先天免疫受体，能够增强TLR依赖的免疫应答，其过度激活会导致“细胞因子风暴”，引发失控性炎症。TREM-1的激活始于受体二聚化，随后释放可溶性胞外域sTREM-1，并触发两条信号通路：一条通过酪氨酸蛋白激酶级联激活转录因子NFκB，上调促炎基因表达；另一条诱导细胞毒性T淋巴细胞，杀伤逃逸免疫监视的肿瘤细胞。目前已鉴定出多种TREM-1配体，包括肌动蛋白、RNA结合蛋白、埃博拉病毒糖蛋白、先天免疫蛋白PGLYRP1（Tag7）以及HMGB1和Hsp70等。Mts1（S100A4，metastasin-1）是一种多功能蛋白，既促进肿瘤进展，也参与免疫保护。前期研究显示Mts1能与Hsp70结合介导细胞毒性T淋巴细胞与HLA阴性肿瘤细胞的黏附，并激活淋巴细胞的趋化性。此外，Mts1与Tag7表位肽17.1复合物可杀伤TNFR1阳性肿瘤细胞。这些初步证据提示Mts1可能作为TREM-1配体。然而，Mts1与TREM-1的直接相互作用、其激活TREM-1的功能及其活性表位尚未明确。因此，本研究旨在：①研究Mts1及其功能肽片段与TREM-1在溶液和细胞表面的相互作用；②鉴定Mts1或表位肽作用后促炎细胞因子基因的表达；③表征Mts1或表位肽通过TREM-1依赖途径激活细胞毒性淋巴细胞的特性。该论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。

**关键技术与方法**
研究人员采用以下主要技术方法：①微尺度热泳（Microscale Thermophoresis）检测Mts1或M7肽与sTREM-1的结合亲和力；②共聚焦显微镜观察RAW264.7小鼠巨噬细胞表面Mts1与TREM-1的共定位；③酶联免疫吸附试验（ELISA）定量检测细胞上清中sTREM-1、IL-6和TNF的分泌水平；④RT-PCR分析U937人原单核细胞中促炎细胞因子mRNA的表达变化；⑤限制性胰蛋白酶水解结合Superdex Peptide柱分离Mts1肽段，并通过MALDI鉴定活性肽序列；⑥细胞毒性实验（Cytotox 96试剂盒）检测外周血单个核细胞（PBMC）或分选的NK细胞、CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞对HLA阴性肿瘤细胞系K562和Molt-4的杀伤活性。样本来源为健康供体外周血，细胞系包括RAW264.7、U937、K562、Molt-4和L929。

**研究结果**

**2.1 Mts1与TREM-1相互作用并激活该受体**
微尺度热泳实验显示，Mts1与sTREM-1以高亲和力结合，解离常数K_d = 8.88 ± 0.12 nmol，说明两者形成稳定复合物。共聚焦显微镜观察到RAW264.7细胞表面TREM-1高表达，Mts1与TREM-1共定位于细胞膜，共定位细胞占83%。ELISA检测发现，随着Mts1浓度增加，细胞上清中sTREM-1水平升高，表明Mts1诱导TREM-1受体二聚化和胞外域解离，即Mts1是TREM-1的配体。

**2.2 Mts1诱导TREM-1依赖的炎症细胞因子基因表达**
在PMA分化的U937巨噬细胞中，Mts1处理12 h后，IL-1β、IL-6和TNF的mRNA水平分别升高40倍、20倍和10倍。ELISA证实24 h后分泌的IL-6和TNF蛋白呈剂量依赖性增加。

**2.3 Mts1诱导TREM-1依赖的淋巴细胞细胞毒性**
PBMC经Mts1激活6天后，对HLA阴性K562和Molt-4细胞产生细胞毒性，该活性可被抗TREM-1抗体、阻断肽LP17和17.0抑制。细胞毒性随Mts1浓度线性增加，最大效应在1 nmol时达到。对照L929细胞（HLA阳性）无杀伤。

**2.4 Mts1激活三种细胞毒性淋巴细胞亚群：NK细胞、CD8⁺和CD4⁺ T淋巴细胞，并诱导肿瘤细胞程序性死亡**
磁珠分选后，第4天检测到NK细胞和CD4⁺ T淋巴细胞具有细胞毒性，第6天CD8⁺ T淋巴细胞出现活性，而NK细胞活性消失。NK细胞通过分泌颗粒酶B杀伤靶细胞；CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞依赖FasL-Fas相互作用。在3 h孵育时，CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞诱导caspase依赖的凋亡；20 h时则激活RIP1激酶和MLKL，介导坏死性凋亡。Western blot证实靶细胞中pMLKL水平升高。

**2.5 17-mer Mts1表位肽与TREM-1相互作用并诱导受体激活**
限制性胰蛋白酶水解后，只有第7号肽段具备激活细胞毒性淋巴细胞的能力。MALDI鉴定其序列为⁴¹ELPSFLGKRTDEAAFQK⁵⁷，命名为M7肽。微尺度热泳显示M7与sTREM-1的K_d = 5.32 ± 0.09 nmol，亲和力与全长Mts1相当。共聚焦显微镜证实M7与细胞表面TREM-1共定位（78%细胞）。ELISA显示M7剂量依赖性地诱导sTREM-1释放。

**2.6 M7肽激活促炎细胞因子基因表达和细胞毒性淋巴细胞**
RT-PCR显示M7肽处理U937细胞6 h和12 h后，IL-1β、IL-6和TNF的mRNA水平升高。ELISA证实24 h后分泌的IL-6和TNF蛋白呈剂量依赖性增加。M7肽激活的PBMC对K562和Molt-4细胞产生细胞毒性，被抗TREM-1抗体和阻断肽抑制。分选后，第4天NK细胞、第6天CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞表现细胞毒性，机制与全长Mts1相同：NK细胞依赖颗粒酶，T淋巴细胞依赖FasL-Fas，并同时诱导凋亡和坏死性凋亡。

**讨论与结论**
本研究有两个重要发现：①描述了Mts1在免疫应答中的新功能；②鉴定了TREM-1炎症受体的新配体。Mts1（S100A4）最初在转移性肿瘤细胞中发现，被认为促进肿瘤进展。但它在免疫系统细胞中高表达，并参与免疫调节。本工作证实Mts1以高特异性与TREM-1结合，形成稳定复合物，激活TREM-1，导致sTREM-1释放、促炎基因表达上调以及细胞毒性淋巴细胞活化。Mts1的活性表位位于中心区域的17个氨基酸肽段M7，该肽段完全重现全长Mts1的功能。与其他已知TREM-1配体（Tag7、Hsp70、HMGB1）相比，尽管氨基酸序列无同源性，但Mts1诱导相同的TREM-1依赖过程。M7肽可能作为抗炎和抗肿瘤药物的候选分子。**结论**：研究人员发现S100A4（Mts1）蛋白是先天免疫受体TREM-1的新配体。Mts1的片段M7肽也能结合TREM-1受体，并像全长蛋白一样在不同时间点触发细胞毒性NK细胞和T淋巴细胞的出现。激活的淋巴细胞在HLA阴性肿瘤细胞中诱导凋亡和坏死性凋亡。这种新的调节肽可能潜在地用于炎症过程的调控和抗肿瘤免疫的激活。