高压氧通过活性氧依赖性小胶质细胞线粒体动力学重塑减轻脑缺血再灌注损伤

《International Journal of Molecular Sciences》：Hyperbaric Oxygen Attenuates Cerebral Ischemia–Reperfusion Injury Through ROS-Dependent Remodeling of Microglial Mitochondrial Dynamics

　　

高压氧（HBO）在脑缺血再灌注（CIR）损伤中显示出神经保护潜力，但其疗效不一提示其潜在的细胞机制尚未完全明确。研究人员先前表明，HBO以活性氧（ROS）依赖性方式抑制CIR损伤后小胶质细胞NLRP3炎症小体活化；然而，ROS如何与该效应偶联仍不清楚。由于线粒体调节ROS和炎症小体信号，研究人员研究了HBO是否调节CIR损伤中的小胶质细胞线粒体动力学。在成年雄性ICR小鼠（n=71，8-12周龄）中，进行60分钟大脑中动脉闭塞再灌注24小时后，HBO改善了神经功能，减少了梗死面积，并降低了ASC（凋亡相关斑点样蛋白）阳性小胶质细胞/巨噬细胞。在脂多糖/尼日利亚霉素（LPS/nigericin）刺激的原代小胶质细胞中，HBO抑制了IL-1β释放，减少了线粒体碎片化，维持了线粒体膜电位，保持了线粒体融合蛋白2（MFN2）蛋白水平，并降低了DRP1 Ser⁶¹⁶磷酸化，而不改变总DRP1或FIS1表达。MitoTEMPOL在体外消除了HBO介导的对抗线粒体碎片化、MFN2减少和DRP1 Ser⁶¹⁶磷酸化的保护作用。依达拉奉（Eda）与HBO联合使用时，在体内减弱了HBO介导的神经保护作用，并抵消了HBO诱导的MFN2和DRP1 Ser⁶¹⁶磷酸化调节。这些发现支持ROS依赖性小胶质细胞线粒体动力学重塑作为HBO介导的抑制CIR损伤后炎症小体相关炎症的机制。

**研究背景与问题**
脑缺血再灌注（CIR）损伤是急性缺血性卒中溶栓或取栓后常见的继发性损伤，其机制涉及氧化应激、神经炎症等多重通路，目前缺乏有效辅助治疗手段。高压氧（HBO）治疗在多种神经损伤模型中显示保护作用，但临床疗效不一致，提示其细胞机制尚未完全阐明。研究人员前期发现，HBO通过活性氧（ROS）依赖性方式抑制小胶质细胞NLRP3（NOD样受体蛋白3）炎症小体活化，但ROS如何耦合至该效应仍不清楚。线粒体是ROS的主要来源和信号枢纽，同时调节炎症小体激活，因此研究人员提出HBO可能通过调控小胶质细胞线粒体动力学来发挥抗炎作用。该研究旨在验证HBO是否通过ROS依赖性重塑小胶质细胞线粒体动力学，从而减轻CIR损伤，为优化HBO治疗策略提供依据。论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。

**主要技术方法**
研究采用成年雄性ICR小鼠（n=71，8-12周龄，来源：南通大学实验动物中心）建立短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）模型（闭塞60分钟，再灌注24小时）。体外实验分离新生ICR小鼠（P0-P3）皮质原代小胶质细胞，建立脂多糖/尼日利亚霉素（LPS/nigericin）刺激的NLRP3炎症小体活化模型。主要技术包括：TTC染色评估梗死面积、Clark法神经功能评分、免疫荧光共定位检测ASC阳性小胶质细胞、TMRM染色分析线粒体形态和膜电位、Western blot检测线粒体动力学相关蛋白（MFN1、MFN2、L-OPA1、DRP1、FIS1及pDRP1^Ser616），以及使用线粒体ROS清除剂MitoTEMPOL（体外）和ROS清除剂依达拉奉（Eda，体内）验证ROS依赖性。

**研究结果**
**2.1 HBO治疗减轻脑缺血再灌注损伤并抑制小胶质细胞/巨噬细胞中炎症小体活化**
在tMCAO模型中，HBO治疗显著降低神经功能缺损评分（一般和局灶评分）及梗死面积（TTC染色），与缺血再灌注（I/R）组比较差异有统计学意义。免疫荧光显示，HBO组Iba1阳性小胶质细胞中ASC阳性细胞比例及ASC荧光强度均降低，表明HBO抑制了体内小胶质细胞炎症小体活化。

**2.2 HBO抑制LPS/nigericin诱导的小胶质细胞线粒体碎片化并维持线粒体膜电位**
体外实验中，HBO处理显著抑制L/N刺激的原代小胶质细胞释放IL-1β。TMRM染色表明，HBO减轻了L/N诱导的线粒体数量增加，改善线粒体形态参数（平均面积、周长、Feret直径、长宽比、形状因子），并维持了线粒体膜电位（TMRM荧光强度升高），提示HBO保护线粒体网络完整性。

**2.3 HBO防止LPS/nigericin刺激的小胶质细胞中MFN2降低并抑制DRP1 Ser⁶¹⁶磷酸化**
Western blot显示，L/N刺激下调MFN1、MFN2和L-OPA1，但HBO仅选择性维持MFN2蛋白水平，对MFN1和L-OPA1无明显影响。HBO未改变总DRP1或FIS1表达，但显著抑制DRP1 Ser⁶¹⁶磷酸化（pDRP1^Ser616水平及pDRP1^Ser616/DRP1比值降低），揭示HBO通过MFN2维持和DRP1去磷酸化协同调节线粒体动力学。

**2.4 HBO通过ROS依赖性机制调节LPS/nigericin刺激的小胶质细胞中MFN2表达和DRP1 Ser⁶¹⁶磷酸化**
线粒体ROS清除剂MitoTEMPOL（MT）与HBO共处理，逆转了HBO对L/N诱导的线粒体碎片化的保护作用（线粒体数量增加，形态参数恶化），同时消除了HBO对MFN2水平的维持和对DRP1 Ser⁶¹⁶磷酸化的抑制，表明HBO的线粒体保护作用依赖ROS信号。

**2.5 HBO通过ROS依赖性机制在体内减轻脑缺血再灌注损伤并调节线粒体动力学相关信号**
在tMCAO模型中，HBO和Eda均能减少梗死面积，但HBO联合Eda组梗死面积较单用HBO或Eda组显著增大，且神经功能评分恶化，接近I/R组，提示Eda抵消了HBO的保护作用。Western blot显示，HBO和Eda均维持了MFN2蛋白水平并降低pDRP1^Ser616水平，但联合治疗组MFN2降低、pDRP1^Ser616升高，表明HBO的体内神经保护作用部分依赖ROS相关信号调节线粒体动力学。

**讨论与结论**
讨论部分指出，HBO通过ROS依赖性方式选择性维持MFN2表达并抑制DRP1 Ser⁶¹⁶磷酸化，从而减少线粒体碎片化、维持膜电位，最终抑制NLRP3炎症小体活化。该研究首次提供证据将HBO神经保护与小胶质细胞线粒体动力学重塑联系起来。HBO可能通过双重调节融合（MFN2）和分裂（DRP1磷酸化）来恢复线粒体稳态。ROS在此发挥双相作用：过度ROS有害，而HBO诱导的适度ROS升高是适应性信号，有助于抗氧化防御和线粒体重塑。因此，与强效抗氧化剂联用需谨慎，以免干扰HBO的适应性ROS信号。文中还讨论了上游氧敏感通路（如HIF-1α、KEAP1-NRF2）可能参与调控，但未直接验证。研究结论翻译如下：总之，本研究证明HBO通过适应性ROS依赖性调节线粒体动力学，抑制NLRP3炎症小体活化，从而减轻缺血性卒中后小胶质细胞介导的神经炎症。机制上，HBO维持MFN2表达并抑制DRP1 Ser⁶¹⁶磷酸化，从而维持线粒体完整性和膜电位。这些发现增进了对HBO神经保护机制的理解，支持HBO作为缺血性卒中非侵入性治疗策略的开发，同时提供转化指导：与强效抗氧化剂联合使用应谨慎，以避免干扰HBO的适应性ROS信号。