《Viruses》：Neuroinflammation, Pericyte Dysfunction, and Alzheimer’s Disease-Associated Gene Expression and Pathway Activation in the Brain of SARS-CoV-2-Infected Mice
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SARS-CoV-2感染会导致包括脑在内的多个器官出现短期和长期肺外并发症。SARS-CoV-2感染的神经系统表现从嗅觉丧失和味觉丧失等良性体征到脑炎、卒中和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)进展加剧等严重并发症不等。周细胞(Per
SARS-CoV-2感染会导致包括脑在内的多个器官出现短期和长期肺外并发症。SARS-CoV-2感染的神经系统表现从嗅觉丧失和味觉丧失等良性体征到脑炎、卒中和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)进展加剧等严重并发症不等。周细胞(Pericytes)是脑血管的壁细胞，有助于维持血脑屏障(blood–brain barrier, BBB)、调节脑血流(cerebral blood flow, CBF)、调节神经炎症并清除包括β-淀粉样蛋白(amyloid beta)在内的有毒物质。周细胞表达ACE2（SARS-CoV-2的受体），因此可能受到脑内病毒直接感染或病毒诱导的炎性细胞因子靶向。为进一步研究SARS-CoV-2对周细胞及BBB完整性的影响，研究人员分析了小鼠中SARS-CoV-2感染对脑周细胞、炎症及其他神经病理并发症的长期影响。研究人员用103 PFU的SARS-CoV-2（德尔塔毒株）感染K18（人ACE2转基因）小鼠，并在感染后6、14和30天(post-infection, dpi)分析脑组织。研究人员观察到感染小鼠在6 dpi时体重显著减轻。在所有小鼠的脑中于6 dpi观察到病毒核衣壳蛋白(nucleocapsid protein)和有感染性的SARS-CoV-2，部分小鼠在14 dpi也观察到，但在30 dpi未观察到。该观察结果表明病毒具有嗜神经性，随后在后期时间点被清除。尽管病毒被清除，但包括TNF-α和IFN-γ在内的炎性介质水平在30 dpi前均显著升高。研究人员还观察到脑周细胞水平在14 dpi至30 dpi期间显著减少。重要的是，从14 dpi至30 dpi，观察到促进周细胞死亡的转录因子Friend Leukemia Integration 1 (FLI-1)水平升高。感染小鼠脑内β-淀粉样蛋白1–42(amyloid beta 1–42)水平在6 dpi升高，并维持至30 dpi，且从14 dpi至30 dpi神经元密度下降。此外，研究人员观察到阿尔茨海默病(AD)相关基因如PSEN1、BACE1和APP的表达增加。此外，与对照组小鼠相比，感染小鼠脑中多个神经退行性通路激活增加，包括“G alpha (z) signaling pathway”、“Apelin muscle signaling pathway”和“G beta-gamma (Gβγ) signaling”。总之，观察到的神经病理学和神经退行性疾病进展的独特分子标志物提供了一种新机制，即COVID-19可能通过在感染期间导致周细胞丢失和BBB功能障碍从而促进痴呆/AD。
该研究背景指出，自2019年底SARS-CoV-2出现以来，全球报告约8亿例感染和超700万例死亡，除呼吸系统损害外，神经系统并发症如嗅觉味觉丧失、谵妄、记忆丧失、脑炎乃至阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)进展加剧在急性期及康复后均被报道。流行病学研究显示急性COVID-19康复后数月尤其是老年人AD风险增加，且既往痴呆患者感染后出现认知衰退加速，但SARS-CoV-2导致血脑屏障(blood–brain barrier, BBB)破坏的细胞分子机制尚未明确。周细胞(Pericytes)作为脑血管壁细胞，表达ACE2受体，在维持BBB完整性、调节脑血流(cerebral blood flow, CBF)、清除β-淀粉样蛋白(amyloid beta)及调控神经炎症中起关键作用，其丢失或功能障碍与神经退行性疾病密切相关。鉴于此，研究人员利用K18（人ACE2转基因）小鼠模型感染SARS-CoV-2德尔塔毒株，在6、14、30天(post-infection, dpi)动态分析病毒神经侵袭、周细胞变化、炎症反应、BBB状态、AD相关病理及基因通路改变，以阐明感染诱导长期神经病理的机制。该研究发表于《Viruses》，其结论揭示病毒虽在30 dpi被清除，但持续存在的周细胞凋亡、慢性神经炎症、BBB破坏、Aβ积累及AD相关基因通路上调共同构成远期神经退行风险，为COVID-19与痴呆关联的流行病学发现提供了实验依据。
研究人员主要采用以下关键技术方法：使用SUNY Upstate动物核心设施繁育的12至16周龄K18（人ACE2转基因）小鼠，经鼻感染103 PFU SARS-CoV-2德尔塔变异株，设模拟感染对照并按6、14、30 dpi终点采集脑标本；通过免疫荧光与空斑试验检测病毒核衣壳蛋白及感染性病毒滴度；以CD13为标记行免疫荧光、Western Blot及TUNEL共染评估周细胞数目与凋亡，检测FLI-1表达；ELISA定量IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ等炎性因子；Western Blot与免疫荧光分析Claudin 5、纤维蛋白(fibrin)沉积、淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)、Aβ1–42及NeuN神经元标记；采用RT2 ProfilerTM PCR阵列与RT-qPCR检测84个AD相关基因表达；利用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)进行信号通路富集与机器学习疾病预测；组织学行H&E染色评估炎性细胞浸润，统计采用单因素ANOVA与t检验。
研究结果如下：
3.1. SARS-CoV-2 Exhibits Neurotropism and Induces an Influx/Expansion of Inflammatory Cells into the Brain
研究人员通过免疫荧光检测SARS-CoV-2核衣壳(N-protein)及空斑试验证实，6 dpi所有小鼠脑内存在高水平病毒蛋白与感染性病毒，14 dpi半数小鼠呈低水平，30 dpi均未检出，显示病毒具嗜神经性并在后期清除；H&E显示6 dpi海马区周围及软脑膜炎性细胞浸润增加，14与30 dpi减少，且未观察到N-protein与周细胞标记CD13共定位，提示病毒感染主要定位于海马神经元而非BBB组成细胞。
3.2. SARS-CoV-2 Infection Induces Pericyte Death
尽管未见直接感染周细胞，免疫荧光与Western Blot显示14 dpi起海马及全脑CD13+周细胞显著减少并持续至30 dpi，细胞计数下降；同时FLI-1转录因子在14与30 dpi显著上调，TUNEL与CD13共定位证实周细胞发生凋亡性死亡，表明SARS-CoV-2通过间接炎症机制诱导周细胞丢失。
3.3. Inflammation Analysis in the Brain Post SARS-CoV-2 Infection
ELISA结果显示IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ在6 dpi均显著升高；IL-6与IL-1β在14、30 dpi回落但仍高于对照，而TNF-α与IFN-γ高水平维持至30 dpi，显示病毒清除后脑内仍存在慢性促炎状态，可能与长期神经病理相关。
3.4. SARS-CoV-2 Infection Induces BBB Disruption
Western Blot显示紧密连接蛋白Claudin 5在14与30 dpi显著降低；免疫荧光在14 dpi起检测到纤维蛋白(fibrin)沉积于脑实质，与周细胞减少时间点吻合，证实SARS-CoV-2感染导致BBB完整性破坏及血管源性物质渗漏。
3.5. SARS-CoV-2 Infection Induces APP and Aβ1–42 Overexpression and Neuronal Death
Western Blot与免疫荧光显示感染小鼠脑内APP在14与30 dpi上调，Aβ1–42自6 dpi起升高并持续至30 dpi；抗NeuN免疫荧光表明海马区成熟神经元密度在14与30 dpi显著下降，提示感染引发Aβ积累与神经元丢失等AD样病理。
3.6. SARS-CoV-2 Modulates the Expression of AD-Associated Genes in the Brains of Infected Mice
RT2 PCR阵列分析发现相较模拟组，6、14、30 dpi分别有19、44、33个AD相关基因显著上调（fold change>2.0，p<0.05），包括MAPT、APP、APOE、BACE1、PSEN1等；RT-qPCR验证BACE1、PSEN1、PSEN2、MAPT表达显著增加，显示感染动态调控AD核心基因转录。
3.7. Signaling Pathway Analysis
IPA分析显示感染组脑内“G beta-gamma (Gβγ) signaling”全程上调；“G alpha (z) signaling”与“Apelin muscle signaling pathway”在6 dpi上调；“Thrombin signaling through PARs”在6 dpi激活；“α-adrenergic signaling”在14、30 dpi上调。IPA机器学习预测6 dpi卒中风险增加，14 dpi预测痴呆、tauopathy、AD及脑梗死，30 dpi预测AD与痴呆，与差异表达基因APP、MAPT、PSEN1、BACE1相符。
讨论部分总结：研究人员指出COVID-19虽为呼吸道疾病，但肺外尤其是神经系统并发症常见，长期机制未明。本研究新发现为SARS-CoV-2诱导脑周细胞耗竭，可能通过直接感染与间接炎症凋亡共同实现；周细胞丢失伴随FLI-1上调及TNF-α等炎症持续，导致BBB破坏与纤维蛋白沉积，即便病毒清除后仍存神经血管损伤。慢性炎症、Aβ1–42早期升高可能为抗病毒防御反应，但继而形成病理性聚集，联合APP过表达、神经元死亡及AD基因通路上调，增加AD及相关痴呆(ADRD)风险。K18模型人ACE2表达模式与非生理表达可能解释未见周细胞直接感染，提示炎症本身足以驱动周细胞死亡。综上，SARS-CoV-2感染通过周细胞功能障碍、BBB破坏、神经炎症、Aβ积累、神经元丢失及AD相关基因通路激活等多重路径促成长期神经退行改变，为COVID-19后神经并发症提供机制解释。
结论部分原文翻译：研究人员展示了多重神经病理通路如图8所示：(1)周细胞死亡，(2)BBB破坏与纤维蛋白沉积，(3)Aβ积累，(4)慢性炎症，(5)神经元死亡，以及(6)AD相关基因如MAPT、PSEN1和APP表达增加，以及数个已知促成AD发展的AD相关通路如Gβγ signaling、谷氨酸激活KARs和thrombin signaling的活性在SARS-CoV-2感染小鼠脑中被激活。
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