《Agronomy》：MALDI-MSI-Guided Laser Capture Microdissection Coupled with MS for Integrated Spatial Multi-Omics in Mouse Brain
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空间多组学（Spatial multi-omics）在生物标本（如组织或细胞）的原生空间背景下分析代谢组、脂质组和蛋白质组等生物分子。质谱成像（Mass spectrometry imaging, MSI）已成为绘制感兴趣区域（Regions of inter
空间多组学（Spatial multi-omics）在生物标本（如组织或细胞）的原生空间背景下分析代谢组、脂质组和蛋白质组等生物分子。质谱成像（Mass spectrometry imaging, MSI）已成为绘制感兴趣区域（Regions of interest, ROIs）内区域特异性分子分布的有力技术。激光捕获显微切割（Laser capture microdissection, LCM）联合质谱（Mass spectrometry, MS）（LCM-MS）是另一种成熟的工作流程，能够准确表征ROIs中的生物分子。为推动当前分析应用，研究人员扩展了基质辅助激光解吸电离（Matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI）-MSI引导的LCM-MS工作流程，用于整合多组学分析，并将其应用于小鼠脑组织作为原理验证。MALDI-MSI注释了387种推定代谢物和脂质，揭示了皮层（Cortex）与海马体（Hippocampus）之间不同的分子分布。随后使用LCM将两个区域作为ROIs分离，并通过液相色谱-串联质谱（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）代谢组学、脂质组学和蛋白质组学进行分析，以实现准确的生物分子谱分析。LC-MS/MS代谢组学和脂质组学注释了249种化合物，其中几种在两个区域间表现出明显的丰度模式差异。LC-MS/MS蛋白质组学在两个区域中匹配到超过3500个蛋白质组。生物网络分析揭示了分子通路与已知的区域特异性表型之间的强关联。总体而言，该MALDI-MSI引导的LCM-MS工作流程能够实现全面的空间多组学分析和定量生物分子分析，为复杂生物系统和空间分子组织提供有价值的见解。
研究背景方面，空间多组学（Spatial multi-omics）通过在组织或细胞等生物标本中保留分子空间背景来革新生物分子分析，旨在阐明代谢物、脂质和蛋白质的作用及其在特定生物微环境感兴趣区域（Regions of interest, ROIs）内的相互作用，从而通过综合视角为理解生物网络提供见解并生成假设，因为生物分子保持其原生状态和位置。质谱成像（Mass spectrometry imaging, MSI）在空间多组学领域取得显著进展，可在无标记探针或靶分子先验知识的情况下绘制分子分布图，已扩展至神经科学、癌症生物学和药物发现等多种生物研究领域。其中基质辅助激光解吸电离质谱成像（Matrix-assisted laser desorption/ionization MSI, MALDI-MSI）凭借高空间分辨率和宽质荷比（m/z）范围成为先进技术，可分析小分子代谢物、脂质、肽和完整蛋白质，空间分辨率达5 μm。尽管有这些优势，MALDI-MSI在无靶向组学应用中存在局限：依赖MS1采集导致生物分子注释模糊；虽可进行MS/MS采集但耗时，难以实现高空间分辨率；蛋白质组学进展尤为关键，因样品制备仍具挑战且MALDI-MSI灵敏度落后于传统基于液相色谱-串联质谱（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）的蛋白质组学。激光捕获显微切割联合质谱（Laser capture microdissection coupled with MS, LCM-MS）是空间多组学中另一强大方法，LCM能精确分离特定ROIs，提取生物分子并进行LC-MS/MS分析以在保留组织结构的同时分析代谢物、脂质和蛋白质。MALDI-MSI具视觉空间精度，LCM-MS具独特优势：依赖MS/MS采集实现生物分子准确定性与定量分析；灵敏度极高，尤其蛋白质组学中借助最新MS技术可从LCM蛋白质组学方法鉴定包括低丰度在内的数千种蛋白质（MALDI-MSI可能遗漏）。为推进当前空间多组学应用，研究人员提出MALDI-MSI引导的LCM-MS方法，以小鼠脑组织为原理验证评估其分析区域特异性生物分子的能力。论文发表在《Agronomy》。
研究人员用到的主要关键技术方法包括：使用6个月龄雄性C57BL/6J小鼠作为样本来源；进行MALDI-MSI分析（正离子与负离子模式，空间分辨率20 μm，基质分别为DHB与N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐，仪器为timsTOF Flex MALDI2，数据导入SCiLS软件并转imzML格式，在METASPACE中用SwissLipids等数据库注释，SCiLS中做无监督分割）；LCM前对切片行H&E染色确认ROIs，用Leica LMD7000显微镜切割收集组织至80%甲醇；从同一样本LCM收集中提取代谢物、脂质（甲醇-氯仿分离有机相与水相）和蛋白质（沉淀留存）；分别用Waters? Acquity HSS T3 C18柱（疏水代谢物）、Waters? Acquity BEH Amide VanGuard FIT柱（亲水代谢物）、Waters? BEH C8柱（脂质）行LC-MS/MS代谢组学与脂质组学（Orbitrap ID-X Tribrid MS，Compound Discoverer 3.3处理，基于准确前体质量、同位素模式、MS/MS谱库匹配注释）；同一样本蛋白质沉淀经还原烷基化、胰蛋白酶消化、C18脱盐后行LC-MS/MS蛋白质组学（MaxQuant查Swiss-Prot Mus Musculus库，Perseus算丰度，STRING做功能富集，技术重复两次）。
研究结果部分保留小标题说明如下。
3.1. Region-Specific Molecular Distributions Matched by MALDI-MSI（MALDI-MSI匹配的Region-Specific Molecular Distributions）：研究人员以20 μm空间分辨率在正、负离子模式下对小鼠脑组织切片行MALDI-MSI，在METASPACE中以20% FDR分别注释203和184种推定代谢物与脂质。多种化合物具明显空间分布差异，如PE (36:0)、PC (38:4)、PG (38:4)在海马体高表达，PI (36:4)、PE (38:6)、二十二碳六烯酸在皮层更高。SCiLS无监督空间分割突显解剖区分子差异以确定ROIs。因MALDI-MSI主要为MS1级技术无法自信注释，选两ROIs行LCM后继以LC-MS/MS（代谢组、脂质组、蛋白质组）。H&E染色确认解剖区后，从海马体与皮层各分离约1.3×106 μm2组织用于比较分子谱分析。
3.2. Spatial Metabolomics and Lipidomics via LCM-LC-MS/MS（通过LCM-LC-MS/MS的行Spatial Metabolomics and Lipidomics）：研究人员从LCM收集样品用MeOH提取代谢物并沉淀蛋白，MeOH-氯仿混液分有机相（主含脂质）与水相。集成样品制备实现同来源代谢组、脂质组、蛋白质组分析以减生物变异。用C18、酰胺柱（水相）与C8柱（有机相）行LC-MS/MS代谢组与脂质组，Compound Discoverer 3.3对照mzCloud等注释249种代谢物与脂质。C8、C18、酰胺柱分别匹配101、82、66种，仅27种跨两或三柱共有（排除异构体），159种特定柱独有，显多分析柱系统优势。皮层与海马体峰面积比较示代谢物丰度差异：乙酰胆碱（Acetylcholine, ACh）、乙酰-L-肉碱、肌苷、烟酰胺在海马体相对皮层的log2倍数变化>2（无生物重复，属初步需谨慎，待后续验证），这些代谢物既往涉海马体神经保护、突触可塑性调节。
3.3. Spatial Proteomics via LCM-LC-MS/MS（通过LCM-LC-MS/MS的行Spatial Proteomics）：研究人员用代谢物提取后蛋白沉淀行LC-MS/MS蛋白质组学，同来源实现无偏多组学。在蛋白与肽谱匹配（Peptide-spectrum match, PSM）水平1%假发现率（False discovery rate, FDR）下匹配3522个蛋白质组。技术重复皮尔逊相关系数皮层0.970、海马体0.982，示高重现性。无生物重复故用log2倍数变化描述性评估：>1者558种在皮层高丰度，<-1者321种在海马体高丰度。哺乳动物表型本体（Mammalian Phenotype Ontology）富集示皮层高丰度蛋白富 seizure 与运动功能相关表型（契合皮层感觉处理、运动控制、高阶脑功能）；海马体高丰度蛋白富长时程增强（Long-term potentiation, LTP）与突触可塑性相关表型（契海马体生理功能及代谢脂质组观察）。无生物重复故属探索性需谨慎。
讨论部分总结：研究人员指出MALDI-MSI提供小鼠脑区域特异性分子分布（区分海马体与皮层脂质代谢物定位），约400种推定小分子匹配但因主要靠MS1信息自信鉴定受限；整合LCM与LC-MS/MS实现解剖定义脑区自信代谢物、脂质、蛋白质注释，且集成样品制备允同来源三组学分析以减生物变异、无偏多组学解读。各组数据独立分析但趋同于一致区域特异性生物特征：代谢组示海马体相对皮层乙酰胆碱、乙酰-L-肉碱、肌苷、烟酰胺更高（涉神经元能量代谢、神经保护、神经传递、突触可塑性调节）；蛋白质组示海马体高丰度蛋白富LTP与突触可塑性相关哺乳动物表型本体项，虽非直接分子互作但示独立测量捕获海马生物学互补面。皮层亦趋同：代谢脂质组示异于海马体的分子组成，皮层高丰度蛋白关seizure与运动功能（契皮层感觉整合、运动控制、高阶认知处理），多组学独立匹配分子特征契各脑区已知功能特化。海马体蛋白Gria1与Gria2（编码AMPA受体亚基，涉兴奋突触传递与LTP）在海马体更高；既往示胆碱能信号调AMPA受体转运与海马可塑性中突触效能，因此乙酰胆碱增加与突触可塑性相关蛋白富集共现提供互补分子证据支持海马学习记忆作用（非直接因果，但示多分子层整合提供区域脑功能更全面视图）。局限：代谢脂质组无生物重复，蛋白质组仅技术重复，丰度差异与功能富集属探索非统计验证生物差异；未来需生物重复与定量跨组学整合（如通路级、网络分析）验证并阐明区域脑功能分子互作。总体该研究示MALDI-MSI整合LCM与LC-MS/MS可实现同组织来源互补空间代谢、脂质、蛋白质表征；虽数据探索性，但多组学层一致生物信号显该工作流程在探究脑区域特异性分子组织中的潜力。
研究结论部分翻译总结：在该研究中，研究人员建立MALDI-MSI引导的LCM-LC-MS/MS工作流程并演示其用于小鼠脑空间多组学分析的应用。该方法实现同组织来源解剖定义的皮层与海马体区域互补代谢组、脂质组、蛋白质组表征。多组学数据集揭示与这些脑区已知生物学功能一致的区域关联分子差异，说明整合空间分子分析提供跨多组学层互补见解的潜力。虽需特定生物扰动系统的生物重复以完全验证跨组学整合稳健性，但原理验证研究凸显该方法应用于神经退行性疾病与癌症等多种生物系统的潜力。总体而言，该集成平台代表一种有前景的策略，用于空间分辨分子表征与推进生物医学研究中多组学研究。
