《Proceedings of the National Academy of Sciences》：IVT-free, chemically synthesized protein-encoding RNA oligonucleotides for rapid production of personalized cancer vaccines
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个性化mRNA新抗原疫苗在癌症治疗中展现出巨大潜力，但其定制化通常需三个多月，存在错失患者最佳治疗窗口的风险。该延迟主要源于当前mRNA疫苗生产依赖质粒发酵与体外转录（in vitro transcription, IVT），涉及基因合成、质粒构建与细菌发酵、
个性化mRNA新抗原疫苗在癌症治疗中展现出巨大潜力，但其定制化通常需三个多月，存在错失患者最佳治疗窗口的风险。该延迟主要源于当前mRNA疫苗生产依赖质粒发酵与体外转录（in vitro transcription, IVT），涉及基因合成、质粒构建与细菌发酵、IVT及下游纯化等多步复杂流程。化学合成的RNA寡核苷酸如反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, ASOs）无需DNA模板或IVT即可生产，从而实现快速制造，但ASOs长度受限，无法编码蛋白。研究人员引入了一个39核苷酸的不依赖帽结构的翻译增强子（cap-independent translation enhancer, CITE）元件BBV，其可驱动RNA翻译，且BBV与高效的滚环翻译（rolling circle translation, RCT）兼容。研究人员化学合成了含有BBV及感兴趣基因（gene of interest, GOI）、具有特征性5’-OH和3’-P末端的RNA寡核苷酸，其可通过内源性RtcB RNA连接酶环化，并在哺乳动物细胞中通过RCT高效编码蛋白，将其命名为蛋白编码RNA寡核苷酸（Protein-Encoding RNA Oligonucleotides, PEOs）。值得注意的是，与IVT产生的RNA相比，PEOs含检测不到的促炎双链RNA（double-stranded RNAs, dsRNA）且免疫原性极低。研究人员进一步证实PEO-OVA（编码OVA抗原）抑制肿瘤生长的效果与mRNA疫苗相当。在原位胶质瘤模型中，PEO疫苗联合检查点阻断疗法亦显示治疗获益。本研究建立了无IVT的RNA疫苗平台，可实现个性化癌症疫苗的快速、安全及高成药性制造，具备显著的临床应用潜力。
研究背景方面，个性化mRNA癌症疫苗虽具治疗前景，但工业生产依赖质粒发酵与体外转录（in vitro transcription, IVT），涉及基因合成、质粒构建、细菌发酵、IVT及纯化等多步复杂流程，耗时长达三个月以上，易使患者错失最佳治疗窗口。IVT过程产生的双链RNA（double-stranded RNAs, dsRNA）杂质会诱导强烈先天免疫响应，导致RNA降解与翻译抑制，现有纯化或修饰策略难以完全消除免疫刺激。化学合成的RNA寡核苷酸如反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, ASOs）无需DNA模板与IVT，可快速制造且安全性高，但受限于长度通常小于150核苷酸，无法容纳5’-帽（5’-Cap）、3’-聚腺苷酸尾（poly(A) tail）或约500至700核苷酸的内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES），因而不能编码蛋白。目前虽有研究尝试化学合成编码蛋白的RNA寡核苷酸，但存在合成复杂、翻译效率低或需额外酶促/化学环化增加制造时间与质控难度等问题。因此亟需开发无IVT、快速、安全且能编码蛋白的RNA疫苗平台。研究人员开展了无IVT的化学合成蛋白编码RNA寡核苷酸（Protein-Encoding RNA Oligonucleotides, PEOs）平台研究，引入39核苷酸的不依赖帽结构翻译增强子（cap-independent translation enhancer, CITE）BBV元件，利用化学合成具5’-OH和3’-P末端的RNA寡核苷酸，借助内源性RtcB RNA连接酶实现细胞内环化并通过滚环翻译（rolling circle translation, RCT）高效表达蛋白。研究显示PEOs几乎无dsRNA杂质与免疫原性，在黑色素瘤与原位胶质瘤模型中显著抑制肿瘤生长并与抗PD-1疗法协同，效果媲美传统mRNA疫苗。该研究发表于《Proceedings of the National Academy of Sciences》，建立了快速、安全、高成药性的个性化癌症疫苗制造范式，具有重要临床转化意义。
关键技术方法方面，研究人员主要采用以下方法：筛选并评估来自文献与数据库的28个CITE元件，通过流式细胞术与蛋白质印迹评估BBV驱动的翻译能力；化学固相合成具5’-OH与3’-P末端或对照5’-OH/3’-OH末端的RNA寡核苷酸，利用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Urea-PAGE）、RNase R消化与Sanger测序验证RtcB介导的环化；通过蛋白质印迹、流式细胞术与液相色谱串联质谱（LC–MS/MS）验证RCT产物；利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测dsRNA杂质，蛋白质印迹检测蛋白激酶R（protein kinase R, PKR）磷酸化，反转录定量PCR（RT-qPCR）与转录组RNA测序分析免疫基因表达与细胞毒性；构建编码卵清蛋白（ovalbumin, OVA）肽的PEO-OVA并经脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles, LNP）包封，在C57BL/6 J小鼠皮下B16F10-OVA肿瘤模型与IDH-R132H突变原位胶质瘤GL261模型中评估疫苗疗效与抗PD-1联合治疗效果；利用T4 RNA连接酶进行体外连接扩展PEO编码长度以探索蛋白替代治疗潜力。
研究结果部分保留原文小标题并依内容总结如下：
Short CITE Elements Enabled Translation Initiation of RNAs。研究人员收集28个CITE元件分析长度与终止密码子，发现黑甲虫病毒（Black Beetle Virus, BBV）仅39核苷酸且含单一可移码规避的终止密码子。将含各CITE元件的增强绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP）编码RNA转染HEK293T细胞，流式细胞术显示BBV具显著蛋白翻译能力。构建含BBV变体的环状RNA（circRNAs）转染细胞，蛋白质印迹表明缺失BBV或反向BBV无蛋白表达，截短或突变BBV显著降低翻译，证明完整BBV序列对环状RNA翻译至关重要。计算对接提示BBV可能与真核翻译起始因子4 gamma（eukaryotic translation initiation factor 4 gamma, eIF4G）相互作用，支持其促进翻译。在化学合成长度限制下，BBV可作为驱动PEO通过RCT高效翻译的候选元件。
Chemically Synthesized RNA Oligos with 5’-OH and 3’-P Termini Could form CircRNAs in Mammalian Cells。研究人员假设具5’-OH与3’-P末端的化学合成RNA寡核苷酸可作为RtcB底物环化为环状RNA（circRNAs）。体外RtcB孵育后Urea-PAGE显示5’-OH/3’-P RNA迁移率改变，对照5’-OH/3’-OH无变化；RNase R消化证实环化产物抗消化，形成拓扑闭合环状RNA。转染哺乳动物细胞后经Sanger测序确认细胞内精确环化，证明化学合成具特征末端的RNA寡核苷酸可被内源性RtcB连接为环状RNA。
Circularized Chemically Synthesized RNA Oligos Achieved RCT in Mammalian Cells。转染同剂量RNA寡核苷酸后，仅无终止密码子的5’-OH/3’-P RNA在HEK293T中产生Flag蛋白，蛋白质印迹显示表观分子量超180 kDa，符合RCT特征高分子量多肽；LC–MS/MS鉴定到跨BBV与Flag编码序列的特异性肽段HATMDYK，直接证明RCT发生；插入P2A序列后出现梯状Flag表达模式，进一步确认RCT。在A549、HeLa及人原代T细胞中，5’-OH/3’-P且无终止密码子的RNA均驱动翻译，证明具5’-OH/3’-P末端与BBV的PEO可通过RtcB环化并在哺乳动物细胞中经RCT产蛋白。
PEO Demonstrated Minimal Immunogenicity and Low Cytotoxicity。ELISA显示PEOs中dsRNA杂质检测不到，而未修饰mRNA、m1ψ修饰mRNA及含Twister核酶IVT RNA（icRNA）均有显著dsRNA污染。蛋白质印迹显示未修饰mRNA与icRNA诱导蛋白激酶R（phosphorated PKR, p-PKR）强磷酸化，PEO仅极低水平且低于m1ψ-mRNA组。PEO在A549与HeLa中细胞毒性低，半数细胞毒性浓度（50% cytotoxicity concentrations, CC50）显著高于m1ψ-mRNA。RT-qPCR显示PEO诱导的IFNA1、DDX58、IFNB1、CXCL10、CCL5、IL6等先天免疫基因表达显著低于未修饰mRNA与icRNA，对RIG-I表达影响极小；转录组RNA测序与原代T细胞免疫相关基因热图均显示PEO免疫特征近似未处理对照，证实PEO具极低免疫原性与低细胞毒性。
PEO-Based Cancer Vaccine Significantly Inhibited Tumor Growth。研究人员构建编码OVA肽SIINFEKL的PEO-OVApeptide，转染DC2.4树突状细胞后流式细胞术证实主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）呈递OVA肽效率显著高于icRNA与全长OVA线性mRNA。LNP包封PEO-OVA皮下或肌肉注射免疫B16F10-OVA荷瘤C57BL/6 J小鼠，外周血与脾脏OVA特异性CD8+ T细胞比例及CD44+活化CD8+ T细胞升高，肿瘤显著抑制。基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）显示PEO-OVA上调抗原受体介导、CD28家族共刺激及T细胞共刺激信号等适应性免疫通路；免疫组化（immunohistochemistry, IHC）显示肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中CD8+ T细胞浸润增加。与m1ψ修饰mRNA、PIE来源环状RNA、icRNA头对头比较，PEO-OVA抑瘤效果相当且生存获益显著优于未处理组，证明PEO疫苗疗效媲美传统mRNA疫苗且具无IVT制造优势。
PEO-Based Glioma Vaccine Showed a Promising Treatment Effect and Could Synergize With Immune Checkpoint Blockade。在IDH-R132H突变原位胶质瘤GL261模型中，单独抗PD-1疗效有限，PEO疫苗轻度抑制肿瘤，联合抗PD-1显著增强疗效，提示PEO重塑肿瘤微环境（TME）为免疫应答状态。与IVT来源环状RNA比较，疾病进展后期IVT环状RNA无法抑制肿瘤，PEO效果更优且联合抗PD-1放大疗效；因IVT环状RNA引发较高炎症反应可能损伤脑组织的考虑，PEO更适于胶质瘤疫苗。研究人员还用T4 RNA连接酶将两PEO序列连接为252核苷酸前体再经RtcB环化，可在HEK293T中翻译，扩展PEO编码容量并展示蛋白替代治疗潜力。
讨论部分总结如下：个性化癌症疫苗临床转化受限于传统平台生产耗时长达三个月以上，错失患者治疗窗口；蛋白疫苗需复杂表达纯化，常规RNA疫苗依赖多步制造。研究人员建立无IVT快速范式，引入39核苷酸BBV元件，借内源性RtcB介导的5’-OH/3’-P末端环化实现体内滚环翻译（RCT），绕过5’-Cap、poly(A) tail及长IRES，定义此类RNA为PEOs。化学合成从根本消除IVT不可避免的dsRNA等杂质引发的先天免疫风险，具极低免疫原性与高安全性，可拓展至蛋白替代疗法与耐受原疫苗。PEO合成纯化流程与反义寡核苷酸（ASOs）相近，可借用现有合同研发生产组织（Contract Development and Manufacturing Organization, CDMO）平台与监管路径加速产业化，缩短至临床周期。局限在于可通过理性设计BBV与感兴趣基因（gene of interest, GOI）密码子优化提升翻译效率，引入5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine, 5hmC）等化学修饰增强稳定性，目前借T4连接可达252核苷酸，未来RNA合成技术进步可扩编码复杂蛋白；PEO亦具蛋白替代如GLP-1及自身免疫病抗原特异性耐受诱导潜力。这些突破将加速PEO平台临床转化。
研究结论翻译部分依原文浓缩如下：研究人员建立了个性化癌症疫苗快速生产范式，通过直接化学合成实现从序列设计到成品的加速转化。引入39核苷酸不依赖帽结构翻译增强子（CITE）BBV元件，虽BBV单独翻译起始效率有限，但与环状RNA滚环翻译协同可实现高效蛋白表达。利用内源性RtcB连接酶在化学合成RNA寡核苷酸上设置5’-OH与3’-磷酸末端，实现高效细胞内环化与体内RCT蛋白生产，确立无5’-Cap、poly(A) tail及环状RNA所需长IRES的技术基础，将此类具翻译起始元件与5’-OH/3’-P末端的化学合成RNA寡核苷酸命名为PEOs。在追求疗效的同时安全性为核心要求，化学合成策略从根本消除IVT过程不可避免之dsRNA等杂质引发的过度先天免疫与临床安全风险，合成流程严格质控使产品具极低免疫原性与良好安全性，优势不仅限于癌症疫苗，亦为遗传性蛋白缺乏疾病的蛋白替代疗法及自身免疫病的耐受原疫苗提供广阔路径。药物开发需临床前系统安全评价，但个性化癌症疫苗存在窄治疗窗口与传统长周期安全评价的矛盾，亟需可快速部署且不妥协安全的稳健平台。PEO技术与既有反义寡核苷酸（ASOs）在治疗流程、高成药性、稳健制造与明确质控标准上高度契合，可借助现有ASO药物CDMO平台与监管审评路径，显著加速由实验室至工业生产转化，大幅缩短疫苗制备至临床应用周期，为个性化癌症治疗紧迫需求提供可行技术方案。仍存在改进空间：理性设计CITE元件如BBV与GOI密码子优化有望提升翻译效率；5hmC等化学修饰可改善PEO稳定性与效力；目前借T4介导连接步骤可使PEO达252核苷酸，未来RNA寡核苷酸合成技术突破长度限制将扩展复杂治疗蛋白编码能力；PEO技术亦在GLP-1等蛋白替代疗法具前景，或为单基因遗传病提供策略；因其极低免疫原性与低细胞毒性，PEO可用于自身免疫病诱导抗原特异性免疫耐受。上述技术突破与概念创新将加速PEO平台临床转化，为患者带来潜在治疗希望。
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