重新思考动物园动物福利中的负强化：一种以距离作为强化物解决恐惧和攻击的建设性方法

《Animals》：Rethinking Negative Reinforcement in Zoo Animal Welfare: A Constructional Approach to Distance as a Reinforcer to Address Fear and Aggression

　　

本研究评估了饲料中添加CpG寡脱氧核苷酸（CpG ODNs）对凡纳滨对虾（*Litopenaeus vannamei*）生长性能、免疫、消化功能、肠道微生物群及转录组反应的影响。初始体重为0.30 ± 0.02 g的虾被投喂添加0、0.1、0.4、1.6、6.4或25.6 mg kg^-1 CpG ODNs的饲料，为期8周。饲料CpG ODNs未显著改善大多数生长参数；然而，投喂添加1.6 mg kg^-1 CpG ODNs饲料的虾表现出较低的饲料转化率。在白斑综合征病毒（WSSV）攻毒后，投喂添加25.6 mg kg^-1 CpG ODNs饲料的虾存活率高于对照组，而副溶血弧菌（*Vibrio parahaemolyticus*）攻毒后各组间存活率无显著差异。饲料中添加0.4 mg kg^-1以上水平的CpG ODNs提高了几种血清免疫相关酶和抗氧化酶的活性，降低了丙二醛（MDA）含量，并增强了肠道胰蛋白酶和淀粉酶活性。此外，该处理增加了微生物丰富度指数，同时降低了弧菌（*Vibrio*）和发光杆菌（*Photobacterium*）的相对丰度。转录组分析显示，与对照组相比，CpG ODNs（0.4 mg kg^-1以上）组中多个通路显著富集，包括AMPK信号通路和JAK–STAT信号通路。总之，饲料中添加CpG ODNs未显著改善凡纳滨对虾的生长性能，但0.4 mg kg^-1以上水平的添加有助于增强免疫和消化功能，并调节肠道微生物群组成。

**论文解读：饲料中添加CpG ODNs对凡纳滨对虾生长、免疫、消化及肠道微生物的影响**

**研究背景与问题**
凡纳滨对虾（*Litopenaeus vannamei*）是全球广泛养殖的甲壳动物，在海水养殖和国际贸易中占据重要地位。集约化养殖虽提高了生产效率，但也使对虾暴露于病原感染、环境波动、高密度养殖及营养失衡等多重生物与非生物胁迫因子下，导致免疫能力下降、氧化还原稳态失衡、消化吸收功能受损，最终降低生长性能、饲料利用率和存活率。因此，开发支持免疫、抗氧化防御、消化功能和肠道稳态的营养策略对虾类养殖可持续发展至关重要。功能性饲料添加剂（如益生菌、益生元、植物源生物活性化合物及免疫刺激剂）已被广泛研究。其中，含非甲基化CpG基序的合成寡脱氧核苷酸（CpG ODNs）可模拟微生物DNA的免疫刺激信号，在脊椎动物中激活模式识别受体（PRR）介导的信号通路，刺激先天性和适应性免疫。在水生动物中，CpG ODNs已被报道能增强病原抵抗、提高免疫和抗氧化酶活性、调节免疫相关基因表达并改善应激耐受。在甲壳动物中，前期研究多集中于固定添加水平下的序列筛选或机制表征，但对多序列复合CpG ODNs制剂的剂量-效应关系、有效添加范围及最适添加水平仍缺乏了解。此外，不同添加水平是否引发协调性或终点特异性的反应（如饲料利用、消化功能、免疫状态、疾病抵抗、肠道微生物及宿主转录调控）尚不清楚。基于此，研究人员假设多序列复合CpG ODNs制剂的分级添加可诱导凡纳滨对虾生理、免疫、微生物和转录状态产生剂量依赖且可能非线性的响应。本研究旨在评估分级添加该制剂对凡纳滨对虾生长性能、免疫状态、消化功能、疾病抵抗、肠道微生物组成及转录组反应的影响，为开发绿色、安全、高效的功能性饲料添加剂提供理论依据，并减少养殖中对抗生素和化学疗法的依赖。论文发表在《Animals》。

**主要技术方法**
研究人员设计了一种复合CpG ODNs，将五种已知免疫刺激序列（ODN1651、ODN2395、ODN2006、ODN2216、ODN1681）的CpG基序区域串联排列。以鱼粉、豆粕、花生粕、玉米蛋白粉为蛋白源，玉米油、大豆卵磷脂、鱼油为脂源，配制六种等氮等脂饲料，分别添加0、0.1、0.4、1.6、6.4、25.6 mg kg^-1 CpG ODNs，对应C0、C0.1、C0.4、C1.6、C6.4、C25.6组。随机选取540尾初始体重0.30±0.02 g的健康凡纳滨对虾，每组3个重复（每重复30尾），饲养于0.3 m³水槽中，每日投喂4次，为期8周。饲养结束后，采集血淋巴、血细胞和肠道样本，测定血清免疫和抗氧化指标（溶菌酶LZM、酸性磷酸酶ACP、碱性磷酸酶AKP、超氧化物歧化酶SOD、酚氧化酶PO、天冬氨酸氨基转移酶AST、丙氨酸氨基转移酶ALT、丙二醛MDA）、肠道消化酶（胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）活性；进行副溶血弧菌（1.0×10⁶ CFU g^-1）和WSSV（1.0×10⁵ copies g^-1）攻毒试验；采用16S rDNA测序分析肠道微生物群落；利用Illumina HiSeq 2000平台进行血细胞转录组测序，并通过qPCR验证差异表达基因（DEGs）。所有数据采用SPSS 22.0进行单因素方差分析（ANOVA）及Duncan多重比较，攻毒存活率用Kaplan-Meier曲线和log-rank检验。

**研究结果**

**3.1 生长性能**
与对照组相比，C1.6组饲料转化率（FCR）显著降低，但初始体重、终末体重、增重率（WGR）、存活率、特定生长率（SGR）在各组间无显著差异。基于WGR和SGR的回归分析预测最适添加量分别为12.65和12.75 mg kg^-1。

**3.2 攻毒试验**
副溶血弧菌攻毒后，各组存活率随时间下降，但72 h时组间无显著差异。WSSV攻毒后120 h，C25.6组存活率显著高于对照组，其他组无显著差异。

**3.3 血清生化指标**
与对照组相比，C6.4和C25.6组LZM活性显著升高；C25.6组AKP活性显著升高；各添加组ACP活性均显著升高，C6.4组最高；除C0.1组SOD、C0.1和C0.4组CAT外，CpG ODNs添加组SOD、PO、CAT活性均显著升高，C6.4组SOD和CAT最高，C1.6组PO最高；C0.1组AST活性显著升高；C0.4组ALT活性显著升高，但C1.6、C6.4、C25.6组ALT活性显著降低；除C0.1组外，各添加组MDA含量均显著降低。

**3.4 肠道消化酶活性**
C1.6、C6.4、C25.6组胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性均显著升高，其中C1.6组胰蛋白酶和脂肪酶最高，C6.4组淀粉酶最高；C0.4组胰蛋白酶和淀粉酶显著升高，但脂肪酶无显著差异；C0.1组无显著变化。总蛋白含量组间无差异。

**3.5 肠道微生物群落**
**3.5.1 多样性与丰富度**：基于β多样性的主坐标分析（PCoA）显示不同添加水平影响肠道微生物群落结构。α多样性分析表明，CpG ODNs添加组Sobs、ACE、Chao1指数显著高于对照组，Shannon和Simpson指数无显著差异。
**3.5.2 组成**：门水平上，变形菌门、拟杆菌门、浮霉菌门、疣微菌门为优势菌群；CpG ODNs添加组浮霉菌门相对丰度显著升高（C1.6除外）。属水平上，弧菌和发光杆菌相对丰度显著降低（C0.1组弧菌除外），而鲁杰氏菌（*Ruegeria*）在C0.4、C6.4、C25.6组显著升高。

**3.6 转录组测序分析**
**3.6.1 组装与比对**：测序质量良好，平均GC含量>49.80%，Q20>97.17%，Q30>92.28%，比对率>88.65%。
**3.6.2 DEGs分析**：C0 vs C0.1组检测到3200个DEGs（2612上调，588下调）；C0 vs C0.4组1629个（680上调，949下调）；C0 vs C1.6组2015个（1154上调，861下调）；C0 vs C6.4组8294个（3081上调，5213下调）；C0 vs C25.6组1606个（806上调，800下调）。300个DEGs为所有比较组共有。
**3.6.3 GO富集分析**：DEGs注释到51个二级GO子类，涉及细胞过程、代谢过程、生物调节、信号转导、催化活性、转录因子活性等。
**3.6.4 KEGG富集分析**：DEGs分布于41个KEGG子类，涵盖代谢、有机系统、人类疾病、遗传信息处理、细胞过程和环境信息处理六大类。C6.4 vs C0组前20条通路覆盖全部六大类；C0.4、C1.6、C6.4、C25.6组共同显著富集AMPK信号通路和JAK-STAT信号通路。
**3.6.5 qPCR验证**：随机选取12个DEGs进行qPCR，表达趋势与转录组测序一致。

**讨论与结论**
讨论部分指出，饲料中添加CpG ODNs（>0.1 mg kg^-1）未显著改善生长性能，但基于回归分析提示存在潜在剂量依赖趋势，与中华绒螯蟹研究结果的差异可能源于物种、发育阶段、基础饲料、培养条件及对免疫刺激剂的敏感性不同。消化酶活性增强解释了C1.6组FCR降低的原因，但整体生长优势未显现。CpG ODNs（25.6 mg kg^-1）显著提高了非特异性免疫酶活性和WSSV攻毒后存活率，但对副溶血弧菌攻毒无显著保护，可能因弧菌感染需更复杂的抗菌效应机制，而CpG ODNs优先诱导抗病毒免疫。肠道微生物方面，CpG ODNs（>0.4 mg kg^-1）增加了微生物丰富度，降低了机会致病菌（弧菌、发光杆菌）丰度，提高了有益菌（鲁杰氏菌）丰度。转录组分析显示，CpG ODNs诱导的基因表达呈非线性模式，且多个剂量组共同富集AMPK和JAK-STAT信号通路，提示其通过多通路调节免疫调控能力。研究存在局限性：高添加区间（6.4~25.6 mg kg^-1）缺少中间剂量，每组独立水槽数仅3个，统计效力有限，实验在高度控制条件下进行且仅8周，长期效果及商业规模下的成本效益未知。

**研究结论**：饲料中添加CpG ODNs未显著改善凡纳滨对虾的生长性能；但添加25.6 mg kg^-1 CpG ODNs增强了对WSSV攻毒的抵抗力；饲料中添加0.4 mg kg^-1以上水平的CpG ODNs显著提高了消化和免疫酶活性，改善了肠道微生物组成，并诱导了有益的免疫相关转录组反应。