利用生物信息学和机器学习方法识别与心力衰竭相关的乳酰化相关基因

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Identification of lactylation-related genes associated with heart failure via bioinformatics and machine learning approaches

　　摘要
背景：心力衰竭是心血管疾病的终末阶段，全球患病率极高且预后较差。本研究旨在利用生物信息学和机器学习方法，识别与乳酰化相关的基因作为心力衰竭的新诊断生物标志物。

方法：从GEO数据库中获取心力衰竭患者与健康对照组的基因表达数据，结合文献中报道的与乳酰化相关的基因，通过差异表达基因分析及加权基因共表达网络分析筛选出与心力衰竭相关的基因。随后利用机器学习构建诊断模型，并通过外部数据集和动物实验进行验证。

结果：共鉴定出4个核心基因（HLTF、HMGN2、ARGLU1和LSP1），这些基因在心力衰竭患者中均显著上调。9种机器学习模型的AUC值均大于0.9，显示出较高的诊断准确性。在GSE84796数据集及TAC小鼠心脏模型中，qRT-PCR检测也证实这4个基因均存在上调现象。基因集富集分析显示，这些核心基因与多种代谢及相关疾病通路存在关联。

结论：所鉴定的与乳酰化相关的基因，尤其是HLTF、HMGN2、ARGLU1和LSP1，有望成为心力衰竭的潜在诊断生物标志物。基于机器学习的诊断模型具有较高的准确性及临床应用潜力，为心力衰竭的早期诊断和治疗提供了新的思路。

1. 引言
心力衰竭是心血管疾病终末阶段的主要临床表现，全球患病人数超过5550万，5年死亡率高达50%[1]。该病的特征包括左心室重构、神经内分泌系统过度激活以及体液潴留等病理变化[2]。临床上表现为呼吸困难、运动耐力下降以及容量超负荷。尽管B型利钠肽检测和左心室射血分数超声评估已成为核心诊断标准，但约40%的射血分数正常的心力衰竭患者仍面临诊断延迟及缺乏治疗靶点的问题[3]。目前的指南推荐的治疗方案，如血管紧张素转换酶抑制剂、β受体阻滞剂及盐皮质激素受体拮抗剂，虽能改善射血分数降低的心力衰竭患者的预后，但仍有30%的患者心脏功能会持续恶化[4]。近年来，诸如血管紧张素受体-神经肽酶抑制剂和钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂等新型神经内分泌拮抗剂为治疗提供了更多选择。然而，在晚期心力衰竭患者及多器官功能障碍患者中，治疗效果存在显著差异，不良反应风险也较高[5]。鉴于现有诊断和治疗体系的局限性，开发基于生物标志物的精准医疗诊断系统以及针对关键病理环节的治疗策略，已成为当前研究的重要方向。

在心力衰竭研究中，乳酰化已成为代谢调控领域的热点话题。传统上，乳酸被视为心肌缺血或缺氧条件下无氧糖酵解的最终产物，其积累与组织酸中毒及能量代谢紊乱密切相关[6,7]。但最新研究表明，乳酸可通过组蛋白乳酰化参与表观遗传调控，在心肌重构、炎症反应及神经内分泌激活等病理过程中发挥重要作用[8,9,10,11,12]。在压力超载模型中，特异性敲除心肌细胞中的乳酸转运蛋白MCT1可显著改善心脏收缩功能，这表明靶向乳酸代谢网络可能是一种逆转心肌重构的新策略[13]。另有研究发现，心力衰竭患者细胞质中的α-MHC K1897蛋白乳酰化水平降低，导致α-MHC与肌联蛋白之间的相互作用减弱，进而引发心脏功能障碍[14]。在心力衰竭状态下，糖酵解增强会导致心肌细胞内乳酸水平显著上升[15]，为蛋白质乳酰化提供原料。最近有研究在由主动脉横断引起的鼠类心力衰竭模型中发现了组蛋白H3K18的乳酰化现象[16,17]。对心力衰竭中乳酰化修饰的研究不仅有助于深入理解疾病机制，还为开发新的诊断生物标志物和治疗策略提供了理论依据和潜在靶点。然而，参与乳酰化过程的基因众多，如何从中筛选出与心力衰竭相关的关键基因呢？

在本研究中，我们利用机器学习和生物信息学方法来识别心力衰竭中的乳酰化相关基因。首先从Gene Expression Omnibus数据库中获取心力衰竭患者的RNA测序数据，经过大量文献检索后，共鉴定出398个与乳酰化相关的基因。通过分析健康对照组与心力衰竭患者之间的差异表达基因，并结合加权基因共表达网络分析，进一步筛选出与心力衰竭相关的基因。随后利用机器学习构建新的诊断模型，并对这类基因进行深入分析。最后，通过外部数据集及动物实验对这些基因进行验证。期望本研究能加深我们对乳酰化修饰在心力衰竭发病、进展及预后中的作用理解，为揭示心力衰竭的分子机制及其诊断、治疗和预后评估提供重要线索。

2. 材料与方法
2.1 数据来源
本研究中的心力衰竭患者及健康对照组基因表达数据来自Gene Expression Omnibus数据库。共选取了3个数据集用于进一步分析：GSE57338、GSE84796和GSE5406。其中GSE57338数据集用作训练集，GSE84796数据集用于后续验证，GSE5406数据集则用于构建机器学习预测模型。此外，本研究中使用的398个与乳酰化相关的基因取自以往的研究[18,19,20]，相关基因的详细信息见补充表1。

2.2 差异表达基因的鉴定与功能注释
采用“limma”R软件包（版本3.62.2）对数据进行标准化处理及差异分析，以确定心力衰竭患者与健康对照组之间的差异表达基因。差异表达基因的筛选标准为调整后的P值小于0.05，且|log2FC|大于0.263[21,22]。差异表达基因的可视化分析则借助“pheatmap”（版本1.0.12）、“dplyr”（版本1.1.4）和“ggplot2”（版本3.5.1）软件包完成。

为分析心力衰竭患者与健康对照组在功能上的差异，使用“clusterProfiler”软件包（版本4.14.4）对差异表达基因进行基因本体论富集分析和京都基因与基因组百科全书通路分析[23]。分析时采用的参考基因集为“org.Hs.eg.db”（版本3.20.0），统计显著性标准为p值小于0.05，调整后的p值小于0.05则表示存在显著富集现象。GO和KEGG分析的结果图均用“ggplot2”软件包（版本3.5.1）生成，而KEGG通路网络图则通过“enrichplot”软件包（版本1.26.6）制作。

2.3 加权基因共表达网络分析及外部数据验证
将“WGCNA”软件包（版本1.73）应用于GSE57338数据集，通过加权基因共表达网络分析探究各模块与疾病状态之间的关联。设定阈值0.25，将相似的模块合并为簇，每个簇的最小规模为30个基因。通过计算双权重中间相关性系数来构建邻接矩阵，仅选择标准差大于0的基因进行进一步分析，同时排除异常值。接着找出与心力衰竭相关性最高的模块，再利用“WGCNA”软件包中的“pickSoftThreshold”函数确定最优软阈值，此处软阈值幂次设置为4（R2值为0.86）。将该矩阵转换为拓扑重叠矩阵后，再通过动态树切割法识别出表达模式相似的基因群。最终选择kME值（即单个基因表达谱与模块特征基因之间的双权重相关性）大于0.5且GS值（即单个基因表达谱与临床指标之间的双权重相关性）大于0.4的基因作为与心力衰竭相关的特征基因[24]。再将这些基因与差异表达基因及与乳酰化相关的基因进行交集分析，从而确定心力衰竭相关的乳酰化基因，也就是所谓的核心基因。随后利用GSE84796数据集进行外部验证，以评估这些核心基因在心力衰竭患者中的诊断价值。

2.4 基因集富集分析
采用“limma”（版本3.62.2）和“clusterProfiler”（版本4.14.4）软件包进行基因集富集分析。该分析方法能够识别数据集中富集的通路，有助于了解单个基因对生物过程的影响[25]。统计显著性标准为p值小于0.05，从中选出高表达组和低表达组中富集程度最高的三个基因集进行可视化展示。

2.5 ceRNA及转录因子调控网络的构建
基于鉴定出的4个核心基因，利用miRWalk、TargetScan和miRDB数据库预测mRNA与miRNA的相互作用对，仅选取三个数据库共同认可的相互作用对进行进一步分析。然后在Spongescan数据库中查找这些预测到的miRNA，识别miRNA与lncRNA的配对关系，进而构建涵盖mRNA、miRNA和lncRNA相互作用的ceRNA网络。此外，还利用JASPAR数据库（http://jaspar.elixir.no/about/）——一个存储转录因子结合序列的数据库——预测这4个核心基因对应的转录因子[26]。这些网络结构通过Cytoscape软件（版本3.10.3）进行可视化展示。

2.6 机器学习预测模型的构建
基于这4个核心基因，利用Python的“sklearn”库（版本1.6.1）构建多种机器学习预测模型，共计开发出9种模型，包括Adaboost、Boosting、KNN、决策树、逻辑回归、朴素贝叶斯、神经网络、支持向量机和随机森林。在GSE5406数据集上对这9种机器学习模型进行重复的分层10折交叉验证，计算所有模型的平均AUC值及其95%置信区间。在随机森林模型中，还采用了SHAP（Shapley加性解释）方法来分析最终预测模型的可解释性[27]。

2.7 心力衰竭小鼠模型的建立
在麻醉状态下，对8周龄雄性小鼠实施主动脉横断术来诱导心力衰竭（采用此方法是为了避免雌激素周期对心脏肥大的影响，这也是TAC模型中的常规操作方式）[28,29]。在实施开胸手术之后，用一根缝线（6-0号缝线）绕在直径为0.42毫米的钝头针上，将主动脉弓在头臂动脉与左颈总动脉之间进行夹闭，夹闭时间约为60秒。在拔出针头之前，先在针头上打结，从而形成一段狭窄区域，使血管直径出现部分缩小。作为对照，接受假手术的小鼠也经历相同的操作流程，但不会进行主动脉夹闭。让这些小鼠饲养8周，使其出现心脏肥大，然后通过M型超声心动图检测手术前后心脏的收缩功能。

2.8 RT-qPCR检测
按照制造商的说明，使用Trizol试剂（#AG21102，Accurate Biotechnology，中国湖南）提取总RNA。随后使用NanoDrop 2000光谱仪（Thermo Fisher Scientific）检测RNA的浓度和质量。接着使用不含gDNA的试剂盒（#AG11728，Accurate Biotechnology，中国湖南）合成cDNA。最后采用SYBR Green Pro Taq HS Premix试剂（#AG11701，Accurate Biotechnology，中国湖南）进行逆转录定量PCR检测。引物序列详见表1，β-Actin被用作样本标准化的内部对照。表1. qRT-PCR引物序列。基因 正向引物（5′-3′） 反向引物（5′-3′）ARGLU1 TCCCGCTCTAAGCACACCACCGGTTCCGTTTGCTCTCCHLTF ATTTCCTGTGATAACCCACTGTGGTGGACTTTACCTTTGAGCTGGHMGN2 TGAAGGGGATGCTAAAGGAGAGTGCCTGGTCTGTTTTGGCLSP1 AGCTGCTGAGGCTCACAACCAGGCTGATGAGTGTCTGCTGβ-Actin GTCCCTCACCCTCCCAAAAGGCTGCCTCAACACCTCAACCC

2.9 组织学分析
将小鼠的心脏取出后，放入10%中性缓冲福尔马林中固定24小时。之后进行石蜡包埋，切出5微米厚的切片，再依次进行苏木精-伊红染色、麦芽胚凝集素染色以及Masson三色染色。最后使用ImageJ软件对染色结果进行定量分析。

2.10 透射电子显微镜观察
将小鼠心脏先用冰冷的PBS溶液清洗两次，然后在室温下用浓度为2.5%的戊二醛在0.1 M的碳酸钠缓冲液中固定过夜。随后将左心室组织切成纵向条带，在4摄氏度下用0.1 mol/L的碳酸钠缓冲液再次固定2小时。经过脱水及包埋处理后，制取超薄切片，并用醋酸铀和柠檬酸铅进行染色。最终通过日本JEOL公司的JEM-1230型透射电子显微镜观察线粒体的超微结构图像。

2.11 西部印迹试验
使用RIPA裂解液（P0038，Beyotime，中国）配合蛋白酶抑制剂混合物（P1005，Beyotime，中国）提取心脏组织或细胞中的总蛋白。对提取到的蛋白进行定量后，通过SDS-PAGE技术分离等量的蛋白，再将它们转移到PVDF膜上。将膜在含有5%脱脂牛奶的TBST溶液（即含0.1% Tween-20的Tris-Borate缓冲液）中于室温下封闭1小时，之后在4摄氏度下与一级抗体过夜孵育。洗涤步骤完成后，再将膜在室温下与HRP标记的二级抗体孵育1小时。最后使用美国Bio-Rad公司的化学发光系统检测蛋白信号，通过LabImage软件（同样来自Bio-Rad公司）分析蛋白条带的强度。β-Actin被用作总蛋白的内部对照。各类抗体的浓度及其稀释比例详见补充表3。

2.12 共免疫沉淀实验
按照Pierce Classic Magnetic IP/Co-IP试剂盒（88804，美国Thermo Fisher Scientific）的说明书，开展共免疫沉淀实验。简而言之，首先用冰冷的PBS清洗小鼠心脏组织，然后将其置于含有蛋白酶抑制剂混合物的IP裂解缓冲液中进行裂解。裂解液在4℃下与针对特定目标的一抗共同孵育过夜，以进行免疫沉淀。之后，抗原-抗体复合物在室温下与Protein A/G磁珠孵育2小时。通过磁分离器收集这些磁珠-抗原-抗体复合物，再用IP洗涤缓冲液洗涤两次，纯化水洗涤一次。结合的抗原用洗脱缓冲液洗脱出来，随后在95℃的加载缓冲液中变性10分钟。正常的IgG被用作后续西方印迹分析的阴性对照。

2.13 统计分析
除非另有说明，所有数据均以均值±标准差的形式呈现。数据分布的正态性通过Shapiro–Wilk检验来判断。对于两个独立组之间的比较，先使用Welch's t检验，再采用Student's t检验。在多假设检验中，包括GSEA通路富集分析和四种核心基因的qRT-PCR验证，均使用Benjamini–Hochberg假发现率法来控制第一类错误。在适用的情况下，会报告调整后的p值（q值）。在WGCNA分析中，使用双权重中间相关性指标构建邻接矩阵，并在选定的软阈值β=4时评估无尺度拓扑拟合度R2。模块的重要性则通过模块特征基因与临床特征之间的相关性来确定，统计显著性则通过双侧t检验来评估。在机器学习模型构建过程中，采用了10折交叉验证，最终呈现所有模型的平均AUC值及其95%置信区间。所有的统计分析都是使用R软件（版本4.3.1）和Python（版本3.10）以及scikit-learn库（版本1.6.1）来完成的。除非另有说明，双侧p值<0.05被视为具有统计学显著性，而在相应结果部分会明确标注经过FDR调整后的q值阈值。

3 结果
3.1 心力衰竭患者中差异表达基因的表达及功能分析
根据调整后P值<0.05且|log2FC|>0.263的标准，共鉴定出2085个差异表达基因，其中包括1095个上调基因和990个下调基因。热图展示了上调和下调程度最高的30个基因（见图1A和B）。

为阐明这些差异表达基因的生物学功能及相关通路，我们进行了基因本体论分析和京都基因与基因组百科全书分析。GO功能富集分析的结果如图1C所示。从生物过程来看，这些差异表达基因与肌肉系统功能、血管发育调控、心脏功能、心脏收缩以及血液循环调节有关。在细胞组分方面，变化主要涉及MHC II类蛋白复合物、细胞基部结构、胶原三聚体以及细胞膜外侧结构。在分子功能方面，这些基因表现出与细胞因子结合、硫化合物结合、肝素结合以及细胞外基质结构相关的作用。KEGG富集分析表明，这些差异表达基因与细胞外基质-受体相互作用、蛋白质消化吸收以及肌细胞中的细胞骨架功能有关（见图1D）。为了探究各通路之间的关联，还展示了按p值排序的三大KEGG通路的网络图谱（见图1E）。值得注意的是，这些差异表达基因在多种与免疫相关的特征中也显著富集，这表明它们可能通过参与能量代谢、调节免疫细胞活性以及调控多种酶的活性，在心力衰竭的发病机制中发挥重要作用。

3.2 通过WGCNA分析及外部数据验证确定心力衰竭中的核心基因
为进一步识别与心力衰竭关联最密切的核心基因，我们对心力衰竭患者组与健康对照组进行了加权基因共表达网络分析。分析结果显示，当β=4时，该网络呈现出无尺度分布特征。随后，利用拓扑重叠矩阵检测与临床特征相关的基因模块（见图2A–D）。研究发现，以下模块与心力衰竭存在显著关联：黑色模块（相关系数=0.77，p=4.2×10^-140）、深青色模块（相关系数=0.90，p=2.9×10^-47）、绿色模块（相关系数=0.83，p=1×10^-200）、青色模块（相关系数=0.56，p=1×10^-200）、紫色模块（相关系数=0.64，p=2.2×10^-61）、粉色模块（相关系数=0.70，p=4.4×10^-90）以及蓝色模块（相关系数=0.90，p=3.5×10^-84）（见图2E）。在这七个模块中，根据其重要性以及相关系数超过0.5的标准，共筛选出了404个基因。最后，通过取这404个基因、2085个差异表达基因以及398个与乳酰化相关的基因的交集，最终确定了四个核心基因：HLTF、HMGN2、ARGLU1和LSP1（见图2F）。关于这些核心基因的详细信息见表2。

随后，使用GSE84796数据集对这些诊断基因的表达情况进行了验证。HLTF、HMGN2、ARGLU1和LSP1的表达趋势与GSE57338数据集中观察到的结果一致。具体而言，与健康对照组相比，心力衰竭患者的HLTF（p=0.0225）、HMGN2（p=0.0020）、ARGLU1（p=0.0015）和LSP1（p=0.0012）的表达水平显著更高（见图2G）。由于本研究中使用的GEO数据集缺乏性别相关的临床注释，因此无法对这四个核心基因进行性别分层分析。未来需要借助包含性别分类的数据开展研究，以确认所观察到的表达异常模式在男女两性中是否一致。

3.3 单基因GSEA分析
为进一步研究这些核心基因在区分心力衰竭样本与健康对照组中的作用，我们进行了基于KEGG通路的GSEA分析（见图3A–D）。该分析显示，每个诊断基因都与多种生物过程存在关联，包括氨基糖和核苷糖代谢、铁死亡、核苷糖生物合成、β-丙氨酸代谢以及叶酸介导的一碳代谢途径。此外，这些基因还与多种疾病相关通路有关，比如1型糖尿病、哮喘以及移植物抗宿主病。完整的GSEA统计参数详见补充表2。

3.4 构建ceRNA调控网络及转录因子预测网络
我们利用miRWalk、TargetScan和miRDB数据库，基于这四个诊断基因构建了ceRNA网络。该网络包含365个节点（4个诊断基因、17种miRNA以及344种长链非编码RNA）和1138条边（见图4A）。具体而言，有134种长链非编码RNA通过与其他四种miRNA竞争性结合，从而调控ARGLU1的表达，这四种miRNA包括hsa-miR-335-5p、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-1197和hsa-miR-138-5p。另外，还有203种长链非编码RNA通过与11种miRNA竞争性结合来调控HLTF的表达，这些miRNA包括hsa-miR-340-5p、hsa-miR-9-5p、hsa-miR-216a-5p、hsa-miR-181d-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-133b、hsa-miR-320d、hsa-miR-4429、hsa-miR-320c以及hsa-miR-320b。此外，还有136种长链非编码RNA通过与两种miRNA结合来调控LSP1的表达，这两种miRNA分别为hsa-miR-331-3p和hsa-miR-665。不过，在ceRNA网络中并未发现任何能够调控HMGN2表达的miRNA对应的长链非编码RNA。

此外，我们还进行了转录因子预测分析，以探讨这些基因的转录调控机制（见图4B）。

3.5 基于机器学习的诊断模型的构建与验证
我们基于GSE5406数据集，采用了九种机器学习模型——Adaboost、Boosting、KNN、决策树、逻辑回归、朴素贝叶斯、神经网络、支持向量机以及随机森林，来评估这四个核心基因在心力衰竭诊断中的重要性（见图5A–I）。所有模型的接收者操作特征曲线下面积值均高于0.9。混淆矩阵显示这些模型具有较高的精确度和召回率，证明了其在预测方面的准确性，同时也显示出其在临床诊断应用中的潜力。通过对随机森林模型进行SHAP分析，可以了解各特征对该模型的贡献程度（见图5J）。在该模型中，HMGN2和HLTF的SHAP值相对较高，表明它们在基于随机森林的诊断分类中具有重要作用。

3.6 TAC模型中核心基因的RNA表达水平上升
在接受横主动脉缩窄手术8周后的小鼠中，其心脏功能明显下降（见图6A和B）。H&E染色和WGA染色结果显示，这些小鼠出现了明显的 cardiac hypertrophy现象，而Masson's trichrome染色则表明手术显著加重了心肌纤维化程度（见图6C–E）。透射电子显微镜观察显示，TAC模型小鼠的心脏存在病理学改变，表现为线粒体空泡化以及嵴密度降低（见图6F）。为在实验上验证这些基因在心力衰竭中的表达水平，我们从TAC组和小鼠组的心脏中提取了RNA。在我们的心力衰竭模型中，确实观察到了明显的心肌肥大以及心脏功能显著下降的现象。同时，我们也发现心力衰竭小鼠的HLTF、HMGN2、ARGLU1和LSP1基因表达水平显著升高，这一结果进一步证实了我们分析的可靠性（见图6G）。此外，Co-IP实验也证实，在TAC模型中HLTF的乳酰化修饰程度显著增加（见图6H）。

4 讨论
作为心血管疾病的终末阶段，心力衰竭严重威胁着全球众多患者的健康与生命安全[[30], [31], [32], [33]]。目前，虽然B型利钠肽检测以及用于评估左心室射血分数的超声心动图已成为重要的诊断手段，但心力衰竭患者仍面临着诊断延迟等问题，而且现有的治疗方法在改善患者预后方面也存在一定局限性[34,35]。因此，寻找新的生物标志物和潜在的治疗靶点对于提升心力衰竭的诊断与治疗水平至关重要。在本研究中，我们通过机器学习与生物信息学方法筛选出了与心力衰竭相关的LRGs，并构建了一种新的诊断模型，为心力衰竭的早期诊断和治疗提供了新的思路。

作为一种新兴的表观遗传修饰方式，乳酰化近年来逐渐成为代谢调控领域的研究热点[[36], [37], [38]]。本研究首次系统地分析了心力衰竭相关LRGs的表达模式，并通过生物信息学方法筛选出了四个与心力衰竭显著相关的核心基因：HLTF、HMGN2、ARGLU1和LSP1。这些基因在心力衰竭患者体内的表达水平明显高于健康对照组，这表明它们有可能成为心力衰竭的潜在生物标志物。这项研究不仅采用了传统的生物信息学分析方法，还结合机器学习技术，通过构建多种预测模型（如Adaboost、SVM和随机森林），来评估这些乳酸化基因在心力衰竭诊断中的重要性。研究结果表明，基于这些基因的诊断模型具有较高的准确性，并具备临床应用前景（AUC值均高于0.9）。多组学整合与机器学习的结合为心力衰竭的诊断提供了新的思路。先前的研究表明，在Ang II诱导的心力衰竭中，α-肌球蛋白重链K1897位点的乳酸化程度降低会影响其与titin的相互作用，进而导致收缩功能异常[14]。同时，通过多组学筛选，我们发现了新的与乳酸化相关的基因，为后续的实验验证提供了参考[39,40]。本研究中鉴定出的四个乳酸化基因可能通过调节能量代谢、免疫细胞活性以及多种酶的活性而参与心力衰竭的发病机制。HLTF与DNA修复和细胞周期调控有关，其表达上调可能反映了心肌细胞在应激状态下的修复机制[[41], [42], [43]]。在心脏器官发生过程中抑制HLTF的表达会损害DNA双链断裂的修复能力，还会导致胶原蛋白生成异常，进而改变将心肌细胞的力量转化为肌肉收缩的结构网络[44]。HMGN2基因与染色质结构和基因表达调控相关，其表达上调可能与心肌细胞的表观遗传重编程有关[45,46]。先前的研究已将HMGN2确定为心力衰竭的标志基因，这进一步证明了我们研究的可靠性[47]。ARGLU1是一种转录共激活因子和剪接调节因子，对应激激素信号传导和发育过程至关重要，在斑马鱼中敲低ARGLU1会导致心脏缺陷[48]。在一项孟德尔随机化研究中，LSP1被证实与原发性醛固酮增多症及多种心脏疾病相关[49]。基因集富集分析进一步揭示了这些关键基因与多种生物学过程及疾病相关通路的关联，如氨基酸糖和核苷酸葡萄糖代谢、铁死亡、核苷酸糖生物合成、β-丙氨酸代谢以及叶酸介导的一碳代谢等，这表明这些基因可能通过调控这些通路而影响心力衰竭的病理进程[[50], [51], [52]]。在动物实验中，我们验证了心力衰竭模型中这些核心基因的表达上调现象，这一结果与生物信息学分析的结果一致，进一步证实了这些基因在心力衰竭中的作用潜力。尽管我们的Co-IP实验结果显示TAC模型中HLTF的乳酸化水平显著升高，但HLTF与乳酸化修饰之间的因果关系仍有待确定。目前尚不清楚HLTF过表达是否直接导致了乳酸化变化，还是其乳酸化水平升高仅仅是心力衰竭状态下整体代谢改变的伴随现象，这一问题需要通过功能缺失和功能恢复实验进一步研究。虽然本研究取得了一些进展，但仍存在一些局限性：首先，数据来自公共数据库，样本量及临床信息（如心功能分类、合并症等）的完整性可能会影响研究结果的普遍性。本研究仅将生物信息学分析与初步的动物实验相结合，并未确立这些核心基因与心力衰竭之间的因果关系。其次，尽管基因表达趋势已通过体外实验得到初步验证，但在动物模型或临床样本中仍缺乏深入的机制研究（如功能获得/功能缺失实验、功能恢复实验以及上下游调控机制的验证），这些基因受乳酸化修饰的具体调控机制也尚未明确。此外，机器学习模型的构建依赖于现有数据集的分布特征，其在新人群中的泛化能力还需进一步验证。目前的发现是基于特定的GEO队列以及雄性TAC模型，而HLTF、HMGN2、ARGLU1和LSP1在雌性动物或女性心力衰竭患者中的表达模式仍有待验证。在公共数据库中进行性别分层分析，或使用雌性小鼠开展专门的动物研究，是未来值得探索的方向。GEO数据集中年龄、用药情况以及合并症等协变量并不完整，这也可能限制研究结果的普遍性。尽管特征选择（差异表达分析和WGCNA分析）和模型训练使用了不同的数据集（GSE57338和GSE5406），但特征选择本身完全基于GSE57338数据集。若在特征选择时使用相同的数据集，可能会导致性能评估结果过于乐观。因此，需要独立的前瞻性队列来验证研究结果的普遍性。总体而言，这项研究通过整合生物信息学分析、机器学习技术以及实验验证，揭示了乳酸化相关基因在心力衰竭中的重要作用，并开发出了新的诊断模型。这些发现表明，HLTF、HMGN2、ARGLU1和LSP1可能是心力衰竭的候选生物标志物，也为未来开展临床前机制研究和治疗验证提供了潜在靶点。

伦理审批与参与同意
该动物实验方案已获得空军军医大学伦理委员会的批准（批准编号：20240007）。

资金支持
本研究得到了中国国家自然科学基金（NSFC，项目编号：8247020695和8240020769）的资助。

CRediT作者贡献说明
张艳：数据整理、可视化、初稿撰写。罗海霞：方法学研究、可视化。贾晓杰：正式分析、研究工作。冯仁谦：方法学研究、初稿撰写。王克新：资源提供、审稿与编辑。赵然：资金筹集、研究工作。齐冰超：资金筹集、审稿与编辑。李岩：概念设计、审稿与编辑。

张艳|罗海霞|贾晓杰|冯仁谦|王克新|赵然|齐冰超|李岩
中国西安710000，第四军医大学唐都医院心脏病科