《Biochemical Pharmacology》：Advanced therapy medicinal products for local treatment using new delivery methods
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过去几年中，越来越多的先进治疗药物产品（ATMPs）获得了上市许可，包括基因治疗、体细胞治疗和组织工程药物，推动了该领域的发展。ATMPs利用递送方法有效地将重组核酸引入靶细胞和组织，通过转移基因序列来治疗患者的疾病或状况。在治疗环境中，研究人员使用具有细胞和
过去几年中，越来越多的先进治疗药物产品（ATMPs）获得了上市许可，包括基因治疗、体细胞治疗和组织工程药物，推动了该领域的发展。ATMPs利用递送方法有效地将重组核酸引入靶细胞和组织，通过转移基因序列来治疗患者的疾病或状况。在治疗环境中，研究人员使用具有细胞和组织特异性的非免疫原性载体，能够提供足够的转基因表达以达到预期效果。此外，自体细胞（如T细胞）可经离体（ex vivo）修饰，以靶向表达表位的组织，例如在癌症和类风湿关节炎治疗中。特定基因或抑制分子的过表达可有效影响细胞调控。全身性基因治疗通常导致较低的特异性，因为它可能影响非预期的组织和细胞，导致脱靶效应和潜在副作用（如肝毒性）。此外，全身性方法通常需要更高剂量才能在目标组织或器官中达到疗效，增加了不良反应的可能性。相比之下，局部细胞和基因治疗可能允许精确递送至靶区域，最大限度地降低风险并改善治疗结果。本综述总结了ATMPs不同递送方法及其所用材料的当前知识，因为应用方法的选择取决于疾病、靶组织和物质特性。它讨论了多种治疗应用中不同递送可能性的优缺点。最后，将总结当前关于局部治疗方法的临床研究和观点。
1. 引言
自2009年组织工程产品ChondroCelect?获批用于软骨缺损，以及随后首个先进治疗药物产品（ATMP）Glybera?获批，标志着ATMP治疗时代的开始。基因治疗是一种相对较新的医学方法，涉及修改或操纵个体细胞内的基因以治疗或预防疾病。这些疗法通常用于传统药物效果不佳或不可用的严重或罕见疾病。与现有治疗产品（如小分子或生物制剂）相比，ATMPs在特性上有所不同，因为使用了整个细胞或病毒载体，表现出不同于小分子的特性（如增殖能力），因此传统的药代动力学概念不易直接转移。确定最佳给药途径可能特别具有挑战性，需要新概念来实现靶位点最佳药物暴露同时确保安全性。
1.1. ATMPs的定义和分类
在欧盟，ATMPs根据(EC)第1394/2007号法规定义，分为三类：基因治疗药物产品（GTMP）、体细胞治疗药物和组织工程药物。GTMP包含或由重组核酸组成，用于调节、修复、替换、添加或删除基因序列，以达到治疗、预防或诊断效果，例如表达SMN1基因的重组腺相关病毒（AAV）9。体细胞治疗药物指经过操作以改变生物学特性并用于体内其他功能以治愈、诊断或预防疾病的细胞和组织。组织工程药物包含经修饰以再生、修复或替换人体组织的细胞或组织。此外，ATMP组合可由多个主要组别组成。美国食品药品监督管理局（FDA）的定义与欧洲不同，使用更广泛的术语“细胞和基因治疗产品”，归入生物制品范畴。
2. GTMP的当前概念和缺陷
目前，EMA已批准17种GTMP，采用不同的治疗给药概念，从全身给药以实现广泛生物分布，到局部递送用于明确解剖目标（如眼睛或大脑）。GTMP一般可分为病毒性和非病毒性递送平台。病毒如慢病毒或AAV具有高转染效率，但存在多种障碍，如预先存在的抗体导致快速清除，以及中和抗体的产生限制治疗持续时间。慢病毒治疗通过插入患者编码区激活癌基因带来致癌风险。AAV疗法克服了插入突变风险，但主要安全问题是炎症反应，特别是在全身性高剂量给药时。局部给药策略因减少全身暴露而受到关注。
2.1. 药代动力学
传统药代动力学-药效学评估不易转移至ATMP治疗，尤其是局部给药时。CAR-T细胞是活体产品，在受体中增殖，受复杂细胞动力学影响，并依赖于多种生物学因素。在AAV疗法中，提出了不同的分析物（如载体、转基因DNA、转基因mRNA和靶蛋白）来描述药代动力学-药效学特性。对于AAV疗法，相关步骤是分布、持久性和清除。确保高效生物分布到靶组织是GTMP的重大挑战。局部给药可以最大化载体在靶组织中的滞留，同时最小化全身播散。例如，通过立体定向神经外科手术进行壳核内输注的Eladocagene exuparvovec，以及视网膜下给药的Voretigene neparvovec，证明了局部递送可降低AAV剂量并仍实现局部转基因表达。
3. ATMP的新配方概念
3.1. 配方和概念
非病毒平台作为病毒载体用于基因治疗药物产品局部递送的有吸引力的替代方案出现，具有可调物理化学性质、较低的内在免疫原性和重复给药的潜力。这些系统通常由脂质、聚合物、肽、无机材料或其组合构建。脂质纳米颗粒（LNPs）是目前临床最先进的核酸递送非病毒系统，可形成包裹DNA或RNA的纳米结构，保护其免受降解。LNPs可通过局部注射适应，其生物降解性、模块化表面功能化和可扩展制造使其适用于组织靶向的GTMP应用。聚合物纳米颗粒由天然或合成聚合物形成，可精确控制粒径、表面电荷和降解动力学，适用于局部递送。短肽（包括细胞穿透肽和归巢肽）可自组装或与脂质和聚合物结合，增强细胞和组织特异性。无机纳米载体（如金、氧化铁和二氧化硅纳米颗粒）提供多功能平台，可结合递送和成像。混合纳米颗粒整合脂质和聚合物组分，旨在协同各类优势。然而，非病毒系统仍面临挑战，如实现病毒水平的转染效率、确保可重复大规模制造和建立长期安全性。
4. AAV作为人类疾病基因治疗的递送载体
AAV因其良好的安全性、广泛的趋向性和在分裂后细胞中维持长期转基因表达的能力，已成为体内基因递送的主要病毒载体。重组AAV（rAAV）载体源自非致病性依赖细小病毒，所有病毒编码序列被治疗性表达盒替换。不同AAV血清型表现出不同的天然器官和细胞趋向性，近期方法利用定向进化和理性衣壳设计来产生增强靶点特异性、穿越血脑屏障或免疫逃逸的工程化血清型。临床研究重点已从全身给药转向局部给药策略，如玻璃体内、肌肉内、脑内和关节内递送，以增强组织特异性、降低载体剂量并减轻全身免疫反应。视网膜下给药利用眼睛的免疫豁免环境，具有低剂量和限制载体于靶组织的优势。鞘内给药日益重要，可绕过血脑屏障等解剖屏障。
4.1. 已获批的疗法
Voretigene neparvovec（Luxturna?）是首个局部体内基因替代疗法，用于治疗双等位基因RPE65相关视网膜营养不良。Zolgensma?（AAV9-SMN1）用于脊髓性肌萎缩症，证明全身AAV9载体可穿越血脑屏障。Delandistrogene moxeparvovec（Elevidys?）用于杜氏肌营养不良症，之后因安全性警告限制了适应症。Beqvez?用于血友病B，但因市场采纳和远期疗效问题而停产。Eladocagene exuparvovec（Upstaza?）是首个获批的中枢神经系统靶向AAV疗法。多个在研临床试验正在进一步研究局部递送AAV策略，特别是针对神经系统和眼部疾病。
4.2. 用于局部递送的AAV-based ATMPs的制造
AAV载体的高效可重复制造仍是临床转化的核心挑战。传统上，rAAV通过瞬时转染哺乳动物生产细胞（如HEK293）产生，使用三质粒系统，具有高灵活性但受限于质粒DNA需求和成本。替代系统使用稳定生产细胞系，可诱导产生，有利于可扩展性和减少质粒输入。杆状病毒表达载体系统（BEVS）使用昆虫细胞，已成为主要工业方法，但可能产生不同的翻译后修饰。下游处理从密度梯度超速离心发展到可扩展的色谱纯化。所有平台都存在生产相关杂质，如空衣壳和宿主细胞DNA。新兴分析显示rAAV可携带残留质粒或宿主来源的microRNA，并显示血清型和平台依赖的衣壳翻译后修饰。局部递送可降低载体需求，从而减少制造压力。
4.3. 评估AAV的免疫原性和安全性
AAV基因治疗的主要转化障碍是人群中预先存在的免疫力，中和抗体（NAbs）可阻止转导，细胞毒性T细胞反应可清除转导细胞。当前方法包括使用低血清流行率或工程化血清型、短暂免疫抑制和新型去靶向衣壳。局部给药部位（如视网膜下或鞘内）的免疫豁免有助于表达持久性。免疫调节策略包括使用皮质类固醇控制免疫毒性，以及从载体设计角度减少免疫刺激基序。临床预防性免疫抑制是管理基石。此外，AAV载体主要非整合，但低频整合事件引起对基因毒性的关注，局部给药可降低总载体负担。
4.4. 临床展望和观点
目前全球有超过250个AAV基因治疗试验活跃，局部给药后显示出持久表达。局部给药的AAV载体预计将在下一代ATMPs中发挥越来越重要的作用，未来需要结合优化的载体生物学和适当的递送策略。
5. 支持局部给药ATMPs开发的实验模型
体外研究在局部治疗的ATMPs中发挥关键作用，特别是通过使用创新递送系统，用于评估靶向递送、组织相容性和治疗疗效，符合3R原则。细胞培养和组织外植体是研究ATMPs与不同细胞类型和组织相互作用的最先进方法，可精确控制变量，便于高通量筛选。2D单层、3D培养、共培养和类器官可模拟组织复杂性。
5.1. 组织工程中的创新应用
使用载有重组人表皮生长因子的纳米结构脂质载体（NLC-rhEGF）可提高人皮肤角质形成细胞原代培养的效率。骨软骨类器官复制骨骼和软骨，用于研究关节相关疾病，提供生理相关模型。组织外植体保留天然细胞外基质结构和细胞组成，允许更真实地评估局部载体渗透和治疗效果。
5.2. 数字和生物工程模型
计算和建模方法可预测组织特异性生物分布、治疗反应和局部暴露，减少实验负担。数字孪生模型包含机械方面，描述组织培养技术、细胞生长、代谢和组织质量。人相关体外模型促进个性化医学，如心脏芯片（HoC）设备复制心脏微解剖和生理学，用于预测性筛选和评估ATMPs疗效。3D生物打印心脏模型使用FRESH?技术制造心肌组织，用于测试细胞疗法和生物材料。
6. 促进ATMPs局部给药的外科手术
ATMPs已从概念发展到临床治疗，越来越多需要外科或介入程序进行递送、整合或组织重建。组织工程产品如Holoclar?（自体角膜缘上皮细胞移植物）需要眼科显微手术。Spherox?（自体软骨细胞球体）通过关节镜植入。Alofisel?（同种异体脂肪来源MSC）通过外科局部注射治疗克罗恩病复杂肛周瘘。GTMPs也涉及外科手术，如Luxturna?视网膜下注射，Upstaza?立体定向壳核输注，Vyjuvek?清创和薄膜基载体应用，Casgevy?骨髓采集和回输。现代ATMPs展现出日益增加的程序多样性，将手术室重新定义为生物递送场所。
7. 展望
多种改善基因和细胞递送的方法已被报道，但临床转化仍存在差距。选择适当的递送平台和给药策略可促进ATMP采用。AAV-based疗法是非增殖组织中附加体持久性的首选载体，LNPs越来越多用于瞬时货（如mRNA或CRISPR）。组合方法如水凝胶储库与LNP结合可能用于未来局部递送。ATMPs显示出不同的药代动力学暴露模式和药效学反应，需要新的概念模型，特别是局部递送策略。靶向资助如JOIN4ATMP倡议和德国clusters4future项目专注于开发先进细胞和基因疗法，包括巨噬细胞、T细胞、自然杀伤（NK）细胞和MSC-based疗法，以及病毒独立基因组编辑策略。这些方法强调局部递送途径和跨专业协作是成功采用ATMPs的基石。
