富含亮氨酸重复序列的蛋白8B（LRRC8B）——内质网应激反应的新型调节因子

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》：Leucine rich repeat containing protein 8B (LRRC8B) – A novel modulator of endoplasmic reticulum (ER) stress response

　　摘要内质网是重要的钙离子储存库，在脂质合成、蛋白质合成及分泌过程中起着关键作用。当内质网功能受损时，错误折叠的蛋白质会积累，从而引发内质网应激。为恢复细胞稳态，细胞会启动未折叠蛋白反应。然而，长期或不可逆的内质网应激可能导致细胞凋亡和死亡。由内质网钙离子平衡紊乱引发的细胞功能障碍和凋亡与神经退行性疾病及代谢性疾病密切相关。我们研究了此前被认为与内质网钙离子平衡相关的常驻内质网蛋白LRRC8B在内质网应激反应中的作用。化学诱导的内质网应激会促使LRRC8B表达升高。在暴露于促内质网应激因子秋水仙霉素的HEK293T细胞中，过表达LRRC8B能提高细胞存活率，而敲低该蛋白则会增加细胞凋亡风险。此外，LRRC8B过表达可通过上调与适应性未折叠蛋白反应相关的保护性基因，如BiP、钙网蛋白和PDI，减少内质网应激期间的蛋白质聚集。相反，敲低LRRC8B会降低BiP表达，并升高CHOP、Bax以及裂解型caspase-3等内质网应激诱导的凋亡蛋白水平。使用化学分子伴侣4-PBA处理可部分挽救因LRRC8B敲低而发生的细胞凋亡。在Neuro 2a（N2a）细胞中，LRRC8B过表达可减少与亨廷顿病相关的突变亨廷顿蛋白HTT-83Q的聚集，而其敲低则会加剧这种聚集现象。总体而言，这些研究结果表明LRRC8B是调控内质网应激反应的关键因子，具有保护细胞的作用。

1. 引言内质网是一种动态的细胞器，既是细胞内的主要钙离子储存库，也是脂质生物合成、蛋白质合成、折叠及成熟的重要场所[1]、[2]。内质网的蛋白质稳态与钙离子信号传导紧密相连：腔内的钙离子浓度可调控分子伴侣的功能及蛋白质折叠过程，而内质网钙离子平衡的破坏会损害蛋白质稳态并影响整体细胞功能[3]、[4]。当内质网的蛋白质折叠能力不堪重负时，错误折叠的蛋白质会大量积累，进而触发未折叠蛋白反应[5]、[6]、[7]。未折叠蛋白反应通过抑制翻译、提升蛋白质折叠能力以及加速错误折叠蛋白的降解来恢复内质网稳态。在高等生物中，PERK、IRE1和ATF6三种通路协同调控这一反应[8]。在正常状态下，分子伴侣BiP会与这些传感器结合使其处于非活性状态；而在应激条件下，BiP会脱离并与错误折叠的蛋白质结合，从而激活这些传感器[9]、[10]。激活后的IRE1会剪接XBP1 mRNA，生成转录因子XBP1s，而在持续应激情况下，可通过TRAF2–ASK1–JNK通路促进细胞凋亡[11]。ATF6会转移到高尔基体中经蛋白水解激活，其胞质片段可诱导XBP1、CHOP、各类分子伴侣以及脂质生物合成相关基因的表达[12]、[13]。PERK则通过磷酸化eIF2α来降低整体翻译速率，同时促进ATF4的合成，后者又会激活适应性基因，且在慢性应激条件下可引发CHOP介导的细胞凋亡[14]、[15]。若应激状况持续存在，这些通路会从适应状态转向促凋亡信号传导[16]，进而诱发多种病理状态，包括神经退行性疾病[17]、[18]、癌症[19]、糖尿病[20]、[21]以及动脉粥样硬化[21]、[22]。蛋白质错误折叠与聚集是阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病等多种神经退行性疾病的特征，这类现象会超出内质网的质量控制能力[17]、[23]、[24]。亨廷顿病是由于亨廷顿蛋白中的多Q序列扩展，导致蛋白质更易聚集，因此调节未折叠蛋白反应可能成为一种潜在的治疗策略[24]、[25]。含亮氨酸重复序列8的蛋白属于体积调节阴离子通道蛋白。LRRC8家族包含五种同源蛋白，即LRRC8A至LRRC8E，其中LRRC8A是形成体积调节阴离子通道所必需的[26]。功能性通道是由LRRC8A与LRRC8C、LRRC8D或LRRC8E亚基组成的异二聚体构成的。相比之下，LRRC8B与LRRC8A结合的能力较弱，对体积调节阴离子通道的功能贡献也很小[27]。先前的研究表明，LRRC8B定位于内质网，可介导内质网中钙离子的被动泄漏[28]。由于LRRC8B是一种能够改变内质网钙离子水平的常驻内质网蛋白，我们研究了它在内质网应激中的作用。我们在HEK293T细胞中发现，LRRC8B是一种响应内质网应激的基因，可增强适应性未折叠蛋白反应的信号传导。在N2a细胞中，LRRC8B能减少与亨廷顿病相关的HTT-83Q蛋白的聚集。这些发现表明，LRRC8B功能异常可能会推动以蛋白质错误折叠为特征的神经退行性疾病的发展，这类疾病包括帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病。

2. 材料与方法2.1 质粒作为荧光载体对照，我们使用了含有GFP基因的pEGFP-N1质粒和含有DsRed基因的pDsRed-C1质粒（均来自美国Clontech公司）。含有人类LRRC8B cDNA编码序列的pCMV3-LRRC8B-GFPSpark质粒（简称LRRC8B-GFP）购自中国华大基因公司（编号HG24935-ACG）。无标签版本的LRRC8B质粒是通过将LRRC8B cDNA序列克隆到pEGFP-N1质粒的KpnI和NotI限制酶切位点之间制备的，而无标签对照质粒则选用了pCMV6-XL5质粒（来自美国马里兰州罗克维尔的OriGene Technologies公司，编号PCMV6XL5）。Scramble shRNA（编号SHC001）和LRRC8B shRNA（编号SHCLND-NM_015350，TRCN0000167445）购自美国Sigma-Aldrich公司。PCDNA3-FlipGFP（含caspase-3裂解序列）T2A mCherry载体是由舒晓坤赠送的，该载体可从Addgene平台获取（Addgene质粒编号124428）。含有正常多Q序列和扩展多Q序列的亨廷顿蛋白第1外显子的pEGFP -C1-16Q HTT质粒（简称HTT 16Q-GFP）以及pDsRed-C1-83Q HTT质粒（简称HTT-83Q-DsRed）则是来自印度加尔各答博斯研究所的Atin K Mandal博士的赠礼。2.2 抗体针对LRRC8B的抗体（编号HPA017950）和β-actin抗体（编号A2228）购自美国Sigma Aldrich公司。BiP抗体（编号NBP2-59692）和ATF4抗体（编号MAB7218）购自美国Novus Biologicals公司。钙网蛋白抗体（编号2679）、PDI抗体（编号3501）、ATF6抗体（编号65880）、caspase-3抗体（编号9662）以及PARP抗体（编号9542）均购自美国马萨诸塞州丹弗斯的Cell Signaling Technology公司。过氧化物酶偶联的抗兔抗体（编号7074）和抗鼠抗体（编号7076）也来自CST公司。Bcl-2抗体（编号sc-7382）、Bax抗体（编号sc-493）以及黏连蛋白抗体（编号sc-73614）购自美国圣克鲁斯生物技术公司。Living Colors DsRed单克隆抗体（编号632392）购自印度DSS TaKaRa Bio公司。2.3 哺乳动物细胞培养与转染我们从浦那的国家细胞科学中心获得了人类胚胎肾细胞系HEK293T和小鼠神经母细胞瘤细胞系Neuro-2a（N2a）。这些细胞在含10%热灭活胎牛血清的Dulbecco's Modified Eagle Medium高糖培养基（来自美国Gibco公司，编号12800-017）以及1×抗生素抗真菌溶液（来自印度HiMedia公司，编号A002A）的培养液中培养，培养条件为37℃、5%二氧化碳浓度的湿润培养箱环境。所有转染操作均按照制造商提供的方案，使用法国Polyplus公司的jetPRIME polyplus转染试剂（编号114–15）进行。2.4 结晶紫染色我们将HEK293T细胞分别用pCMV6-XL5质粒（对照组）、无标签LRRC8B质粒、Scramble ShRNA质粒以及LRRC8B ShRNA质粒转染后，重新接种到96孔板中，每孔接种10,000个细胞。转染24小时后，这些细胞被不同浓度的秋水仙霉素（来自美国Sigma-Aldrich公司，编号SML1287）或DMSO（来自印度HiMedia公司，编号MB058）处理24小时。那些经过敲低的细胞还同时被2μg/ml的秋水仙霉素和3mM的4-苯基丁酸（4-PBA，来自美国Sigma-Aldrich公司，编号P21005）处理24小时。处理完成后，这些细胞用冰冷的甲醇固定10分钟，然后再与0.1%的结晶紫溶液共同孵育10分钟。随后用清水清洗培养板并将其晾干，最后用30%的醋酸溶液处理以便溶解细胞中的蛋白质。我们使用微板分光光度计（来自Bio-Rad Laboratories, Inc.公司）在570纳米波长处测定吸光度值[29]，细胞存活率则通过比较实验组与对照组的染料强度比值来表示。2.5 LDH检测我们将经过Scramble shRNA和ShRNA转染的HEK293T细胞重新接种到96孔板中，然后用DMSO或不同浓度的秋水仙霉素处理36小时。我们通过CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒（来自英国麦迪逊市的Promega公司，编号G1782）检测培养上清液中的LDH释放量，以此间接判断细胞膜的完整性。我们使用微板读数仪在490纳米波长处测定OD值，颜色强度与细胞破裂的数量成正比。2.6 定量逆转录PCR检测我们将HEK293T细胞接种到35毫米培养皿中，然后让它们在不同的内质网应激因子作用下培养6小时。对照组则仅加入相应的溶剂。为了研究LRRC8B过表达和敲低的影响，我们将处于70%融合状态的HEK293T细胞分别转染GFP质粒、LRRC8B-GFP质粒、Scramble ShRNA质粒以及LRRC8B ShRNA质粒。转染24小时后，这些细胞被2μg/ml的秋水仙霉素或DMSO处理6–8小时。之后我们用总RNA提取试剂RNAiso Plus（来自印度DSS TaKaRa Bio公司，编号9109）提取细胞中的RNA。再使用GoScript逆转录酶试剂盒（来自英国麦迪逊市的Promega公司，编号A5000）合成cDNA。我们首先通过半定量RT-PCR检测XBP1 mRNA的剪接情况。PCR反应时使用50ng的cDNA，以及XBP1的引物对：正向引物为5′-TTACGAGAGAAAACTCATGGCC-3′，反向引物为5′-GGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC-3′，同时还使用EmeraldAmp GT PCR Master Mix试剂（来自印度DSS TaKaRa Bio公司，编号RR310A）。扩增产物会在2.5%的琼脂糖凝胶上电泳分析[30]，作为加载对照的β-Actin基因则使用对应的引物对：正向引物为5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，反向引物为5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。定量实时PCR反应则使用GoTaq qPCR Master Mix试剂（来自英国麦迪逊市的Promega公司，编号A6001），并结合表1中所列的引物对进行检测，基因表达的倍数变化则通过2?ΔΔCT方法计算[31]。所有基因的表达数值都会根据β-Actin基因的表达水平进行校正，以此计算出相对表达比值。表1 本研究中使用的引物列表。基因 正向引物 反向引物 参考文献 引物编号ASK1 CTGCATTTTGGGAAACTCGACTAAGGTGGTAAAACAAGGACGG [32] 21536459c1ATF4 ATGACCGAAATGAGCTTCCTGGCTGGAGAACCCATGAGGT [32] 33469973c1ATF6 AGCAGCACCCAAGACTCAAACGCATAAGCGTTGGTACTGTCTGA [32] 343168761c2BiP TGTTCAACCAATTATCAGCAAACTCTTCTGCTGTATCCTCTTCACCAGT [33] CHOPTTAAAGATGAGCGGGTGGCAACTTCCTTCTTGAACACTCTCTCCTRAF2 CCTTCCCAGATAATGCTGCCCGCTCTCGTATTCTTTCAGGGTC [32] 42544228c2LRRC8A AAGCACTTTGTGTCTATCCTGCCTGACGGTCGATGACTTTTTGT [32] 187829876c3LRRC8B TTTATGCTCAACGGTCTTCCAGGGTCTACGACCAGAGATGAATGG [32] 197333691c3β-ACTIN CATGTACGTTGCTATCCAGGCCTCCTTAATGTCACGCACGAT 2.7 西部印迹检测我们首先用冰冷的1×PBS清洗细胞，然后使用含有10mM Tris-HCl（pH 8）、140mM NaCl、1% Triton X-100、0.1%钠去氧胆酸盐、0.1% SDS、1mM EDTA、0.5mM EGTA的RIPA缓冲液（其中还添加了1mM PMSF和1×蛋白酶抑制剂混合物，来自美国Sigma-Aldrich公司，编号P8340）裂解细胞。将裂解后的细胞在上层清液在4℃下以12000×g的转速离心20分钟，收集上清液。我们使用Bradford法测定上清液中的蛋白质浓度。随后将样本置于含6倍Laemmli加载缓冲液的溶液中，在95℃下加热5分钟，然后放在10%或15%的SDS-PAGE凝胶上电泳，最后将凝胶转移至PVDF膜上（来自Bio-Rad公司，编号1620177）。转移后的膜在含有5% BSA和0.1% Tween-20的pH 7.4的Tris缓冲盐溶液中室温下封闭1小时。之后将膜在4℃下与一级抗体共同孵育过夜，随后在室温下与HRP偶联的二级抗体共同孵育1小时。我们使用ECL化学发光试剂盒（来自Bio-Rad公司，编号1705060）检测膜上的抗原信号，再通过Bio-Rad公司的ChemiDoc? XRS仪器配合ImageLab软件对图像进行处理。最后使用ImageJ软件对蛋白条带的密度进行定量分析。我们以β-Actin或黏连蛋白作为内参基因，用于校正基因表达的数值。2.8 硫黄素T结合检测我们将细胞接种到35毫米培养皿中，当细胞生长到60%融合状态时，转染无标签的LRRC8B质粒或shRNA质粒。转染12小时后，将这些细胞用胰蛋白酶处理，然后重新接种到96孔板中。转染24小时后，这些细胞被2μg/ml的秋水仙霉素处理24小时。我们按照先前的方法制备5mM的硫黄素T储备溶液[34]，然后将5μM的硫黄素T溶解在细胞培养基中，与细胞共同在37℃下孵育15分钟。之后将培养基更换为新鲜的1×PBS。我们使用Agilent BioTek多模式微板读数仪测定荧光强度。硫黄素T是一种小分子，一旦与蛋白质聚集体结合就会发出荧光。内质网应激期间形成的蛋白质聚集体越多，产生的绿色荧光就越强。2.9 荧光显微镜观察与分析对于每种实验条件，我们随机选取3–5个视野进行成像。所有的荧光图像都使用ImageJ和CellSens Dimension软件进行分析。2.9.1 caspase-3活性检测我们将HEK293T细胞接种到35毫米培养皿中，然后同时转染无标签的LRRC8B质粒或shRNA质粒，以及含有caspase-3裂解序列的PCDNA3-FlipGFP（T2A mCherry）载体。这种基于FlipGFP的caspase-3报告载体可用于检测caspase-3的活化情况，检测方法与先前报道的一致[35]。转染24小时后，这些细胞被2μg/ml的秋水仙霉素或DMSO处理24小时。我们使用配备40倍物镜及相应滤光片的Olympus IX83倒置荧光显微镜，结合安装在显微镜上的sCMOS相机（ORCA-Flash4.0，来自Hamamatsu Photonics公司）对细胞进行成像。2.9.2 细胞质钙离子浓度检测我们将HEK293T细胞接种到35毫米培养皿中，当细胞生长到60%融合状态时，转染无标签的LRRC8B质粒或shRNA质粒。转染24小时后，这些细胞被2μg/ml的秋水仙霉素处理12小时。之后我们用含有140mM NaCl、5.6mM KCl、3.6mM NaHCO3、1.3mM CaCl2、1mM MgCl2、5.6mM葡萄糖以及10mM HEPES（pH 7.4）的Hank's Balanced Salt Solution清洗细胞，然后让细胞在含有1μM Fluo-4 AM（来自Invitrogen公司，Molecular Probes产品编号F14201）的溶液中在黑暗环境下37℃孵育30分钟。这些细胞先用HBSS洗涤三次，然后在37℃的黑暗环境中在新鲜HBSS中孵育15分钟，以便进行染料去酯化处理。随后使用带有GFP滤光片的Olympus IX83荧光倒置显微镜和40倍物镜对细胞进行成像。2.10. 共聚焦成像将N2a细胞接种在玻璃底培养皿中，并与HTT 83Q-DsRED构建体、LRRC8B-GFP以及shRNA质粒共同转染。转染24小时后，用1× PBS洗涤细胞，再与2μg/ml的Hoechst 33342染料（Sigma-Aldrich，美国，编号B2261）孵育10分钟。之后再次用1× PBS洗涤细胞，最后在Olympus Confocal显微镜FV3000上通过60倍和100倍油镜观察细胞。根据60倍物镜拍摄的图像，统计每种条件下每个细胞内的聚集体数量。2.11. 统计分析使用Student's t检验比较两组数据，而对于多组数据的比较，则采用单因素或双因素方差分析，再结合Tukey事后检验，所有分析均通过GraphPad Prism 10软件（GraphPad Software, Inc.，加利福尼亚州圣迭戈市）完成。数据以均值±标准差的形式呈现，统计显著性标准为P<0.05。显著性水平用星号表示：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。除非另有说明，实验至少重复三次。3. 结果3.1. LRRC8B具有应答内质网应激并保护细胞的功效将HEK293T细胞分别用各种诱导内质网应激的化学物质处理6小时，这些物质包括氯化镉（CdCl?）、二硫苏糖醇（DTT）、过氧化氢（H?O?）以及冬青霉素。处理完成后，提取总RNA，并按照方法部分所述进行RT-qPCR检测。除了H?O?之外，其他所有应激因子都显著提高了LRRC8B的表达水平（图1A）。而经H?O?处理的细胞虽然也表现出LRRC8B表达升高的趋势，但这种升高并不具有统计学显著性。有趣的是，作为LRRC8B同源基因的LRRC8A的mRNA水平在所有应激因子作用下都会下降（图1B）。不同的内质网应激因子处理还会显著上调已知的内质网应激标志物BiP、EDEM、ATF4、ATF6以及CHOP的表达，这一结果与以往研究一致，也证实了分子伴侣途径的激活，详见图1C–G。下载：下载高分辨率图像（663KB）下载：下载完整尺寸图像图1. 内质网应激状态下LRRC8B表达上升且具有保护细胞作用将HEK293T细胞分别用100μM的CdCl?、2mM的DTT、200μM的H?O?以及2μg/ml的冬青霉素处理6小时，A、B图显示了通过qRT–PCR检测的内质网应激后LRRC8B与LRRC8A的mRNA相对表达水平。C–G图则通过qRT–PCR测定内质网应激标志物BiP、EDEM、ATF4、ATF6以及CHOP的表达水平，并以β-actin作为标准化参考。数据以相对于相应对照组的变化倍数呈现（均值±标准差，n=4组独立实验）。统计显著性通过非配对t检验确定。H–I图显示了在HEK293T细胞中过表达或敲低LRRC8B后，用不同浓度冬青霉素处理后再通过结晶紫染色检测的细胞存活率，数据以相对于未处理对照组的均值±标准差呈现（n=6）。统计显著性同样通过非配对t检验确定。J图展示了在随机序列对照组和LRRC8B敲低组细胞中，分别在有和没有3mM 4-PBA存在的条件下用2μg/ml冬青霉素处理后，通过结晶紫染色检测的细胞存活率，数据仍以相对于未处理对照组的均值±标准差呈现（n=6），统计显著性通过双因素方差分析结合Tukey事后检验确定。K图通过LDH释放试验定量检测了冬青霉素处理后LRRC8B敲低细胞的细胞死亡程度，条形图显示的是均值±标准差，统计显著性同样通过非配对t检验确定，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。（关于图中颜色标注的含义，可参阅本文的网络版本。）为探究LRRC8B在细胞应对内质网应激时的存活中的作用，我们让过表达和敲低LRRC8B的细胞分别接触不同浓度的冬青霉素——这是一种常用的内质网应激诱导剂。Western blot检测结果证实了LRRC8B过表达和敲低的效果（见补充图S1）。LRRC8B的过表达显著提升了细胞存活率，并能保护细胞免受冬青霉素引发的细胞死亡（图1H）。用1μg/ml的冬青霉素处理24小时后，过表达LRRC8B的细胞存活率明显高于对照组。不过在更高浓度的冬青霉素处理下（2、3、5和10μg/ml），过表达作用不足以提供具有统计学意义的保护效果，尽管在所有测试浓度下都能观察到细胞存活率有所上升的趋势。相反，LRRC8B的敲低则会降低细胞存活率，还会使细胞更容易因冬青霉素而死亡，如图1I所示。此外，将冬青霉素与3mM的4-PBA共同处理24小时，无论是在随机序列对照组还是LRRC8B shRNA组中，都能显著提升细胞存活率（图1J）。为了进一步了解LRRC8B敲低会在多大程度上加剧冬青霉素诱发的细胞死亡，我们使用了更低浓度的冬青霉素（0.5、1、2、3μg/ml），并延长处理时间至36小时，细胞死亡程度则通过LDH试验来测定。在所有测试浓度下，敲低组的细胞死亡程度都明显更高（图1K），这一结果与结晶紫染色试验得出的细胞存活率数据相互印证。图S1C&D展示了对不同浓度冬青霉素单独处理以及冬青霉素与4-PBA联合处理后的细胞进行结晶紫染色的典型图像，颜色越深代表细胞存活率越高。可以看出，过表达LRRC8B的细胞存活率更高，而敲低组的细胞存活率则低于对应对照组。4-PBA的联合处理能够在冬青霉素处理期间提升随机序列对照组和LRRC8B敲低组的细胞存活率。3.2. LRRC8B是一种抗凋亡蛋白由于已知内质网应激会诱发细胞凋亡，因此我们利用基于Flip-GFP的报告基因构建体来检测执行型凋亡酶Caspase-3的活性。mCherry荧光用于作为转染对照，而Caspase-3活性的变化则通过GFP荧光的强度变化来体现。这种荧光强度的增加是由于初始无荧光的Flip-GFP报告基因被蛋白水解切割后发生了构象变化所致[35]。我们用冬青霉素处理细胞以诱发内质网应激，相关结果见图2A和B。在LRRC8B过表达的样本中，无论是未经处理还是经过冬青霉素处理，几乎都没有或仅有极少GFP阳性的细胞，而在对照组样本中则能检测到大量GFP阳性细胞。此外，敲低LRRC8B会导致Caspase-3活性上升，表现为GFP阳性细胞的数量比对照组更多。为了量化这些变化，我们计算了不同组别中GFP与mCherry荧光强度的比值（GFP:mCherry），该比值越高说明Caspase-3的活性越强。如图2B所示，在载体对照组和冬青霉素处理组中，LRRC8B的过表达均显著降低了标准化后的荧光比值，而敲低LRRC8B则使该比值上升，尤其是在冬青霉素处理组中更为明显。综合这些结果可知，LRRC8B的过表达能够抑制Caspase-3介导的细胞死亡，而LRRC8B的缺失则会促进Caspase-3的活化及细胞凋亡。接下来，我们在冬青霉素处理24小时后，通过Western blot检测了促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白水平（图2C–H）。正如预期，与转染GFP的对照组相比，无论是否经过冬青霉素处理，LRRC8B过表达细胞的Bax蛋白水平都较低（图2C和D）。相反，敲低LRRC8B的细胞在未经处理时，Bax蛋白水平虽有轻微上升，但并未达到统计学显著性。而在冬青霉素处理后，Bax蛋白水平显著上升，尤其是敲低组相比随机序列转染的对照组，其Bax水平明显更高（图2C和E）。无论是否经过冬青霉素处理，LRRC8B过表达细胞的Bcl-2水平都会上升，而敲低LRRC8B则会导致未经处理细胞的Bcl-2水平较随机序列对照组显著下降（图2F–H）。需要指出的是，虽然Western blot图像（图2C）显示，经过冬青霉素处理的LRRC8B过表达组细胞的Bax水平似乎略高于GFP对照组（从左数第6和第5条泳道），但通过对三组独立实验数据的量化分析发现，当以β-actin作为标准化参考时，LRRC8B过表达组的Bax蛋白水平实际上更低（图2D）。下载：下载高分辨率图像（803KB）下载：下载完整尺寸图像图2. LRRC8B在正常状态及冬青霉素诱导的内质网应激条件下调控促存活和促凋亡基因及蛋白的表达A图通过GFP标记显示Caspase-3的活化情况，绿色荧光强度越高说明Caspase-3的活性越强。B图以GFP/mCherry荧光强度比值（FGFP/FmCherry）的形式量化Caspase-3的活化程度，并以对照组作为标准化参考。条形图表示3组独立实验的均值±标准差，统计分析采用双因素方差分析结合Tukey事后检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001；比例尺：20μm。C图为各实验组Bax蛋白表达的典型Western blot结果。D、E图量化了Bax蛋白的水平，结果显示LRRC8B过表达组的Bax水平较低，且冬青霉素处理带来的Bax水平上升幅度也较小，而敲低LRRC8B则进一步增强了Bax的表达。F图为Bcl-2蛋白表达的典型Western blot结果。G、H图量化了Bcl-2蛋白的水平，结果表明在正常状态及内质网应激条件下，LRRC8B过表达组的Bcl-2水平均较高，而敲低LRRC8B则会导致Bcl-2水平下降。虽然从Western blot结果来看，经过冬青霉素处理后，shRNA敲低组细胞的LRRC8B水平似乎略高于随机序列shRNA对照组（右侧最后两条泳道），但三组独立实验的平均值并未显示出任何统计学上的差异。数据以3组独立实验的均值±标准差呈现，统计显著性通过双因素方差分析结合Tukey事后检验确定，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。（关于图中颜色标注的含义，可参阅本文的网络版本。）接下来，我们检测了LRRC8B过表达和敲低后细胞中全长型及切割型的Caspase-3以及PARP的表达情况。部分敲低组细胞还同时接受了冬青霉素和4-PBA的处理。在所有未经处理和经处理的条件下，全长型Caspase-3（图3A、B、C）以及PARP（图S2A、B、C）的水平均未出现显著变化。冬青霉素处理则显著增加了对照组细胞中Caspase-3（图3A、D、E）和PARP（图S2A、D、E）的切割片段含量，表明内质网应激会增强细胞的凋亡信号通路。与随机序列转染的细胞相比，敲低LRRC8B的细胞中PARP的切割片段以及Caspase-3的切割片段水平均有所上升（图S2A、D和图3A、D）。而LRRC8B的过表达则使得Caspase-3的切割片段水平相对GFP对照组有所下降（图3A、E），同时略微增加了PARP的切割片段水平（图S2A、E）。冬青霉素与4-PBA的共同处理则显著降低了LRRC8B敲低细胞中Caspase-3的切割片段以及PARP的切割片段水平，这说明缓解内质网应激可以减轻细胞凋亡。随后，我们检测了与内质网应激相关的关键凋亡基因ASK1、TRAF2以及CHOP的表达情况。为此，我们在冬青霉素处理8小时（浓度为2μg/ml）后，检测了LRRC8B过表达组和LRRC8B敲低组细胞中这三种基因的mRNA水平。正如预期，冬青霉素显著上调了ASK1、TRAF2以及CHOP的mRNA表达水平（图3F–K）。LRRC8B的过表达则减弱了冬青霉素处理过程中这些基因mRNA水平的上升幅度（图3F、H、I）。而敲低LRRC8B则会在冬青霉素处理期间显著提高ASK1（图3G）和CHOP（图3K）的mRNA水平，同时降低TRAF2的mRNA水平（图3I）。与仅接受冬青霉素处理的细胞相比，同时接受冬青霉素和4-PBA处理的细胞中，这些基因的mRNA表达水平显著更低（图3G、I、K）。下载：下载高分辨率图像（757KB）下载：下载完整尺寸图像图3. LRRC8B敲低会诱导细胞凋亡信号通路的激活，而4-PBA处理可部分抑制这一效应A图为各实验组Caspase-3蛋白表达的典型Western blot结果，包括全长型和切割型。B、C图量化了全长型Caspase-3蛋白的水平，结果显示各组之间并无显著差异。D、E图量化了Caspase-3 17kDa切割片段的水平，结果显示在LRRC8B敲低组细胞中，冬青霉素处理后会增加这类切割片段的产生，而在加入4-PBA的组中则显著减少了这类切割片段的生成；而LRRC8B的过表达则显著降低了Caspase-3切割片段的产生水平，相对GFP对照组而言。柱状图表示的是对三条泳道中的蛋白条带进行密度测量后的均值±标准差，所有数据均以β-Actin的表达水平作为标准化参考，数据来自3组独立实验。F–K图显示了在正常状态、2μg/ml冬青霉素处理条件以及3mM 4-PBA共同处理条件下，LRRC8B过表达组或LRRC8B敲低组细胞中ASK1、TRAF2以及CHOP mRNA的水平，数据以相对于未处理对照组的倍数变化形式呈现（均值±标准差，n=3）。统计显著性通过双因素方差分析结合Tukey事后检验确定，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。3.3. LRRC8B调节适应性分子伴侣途径在内质网应激状态下，分子伴侣途径的激活会提升参与蛋白质折叠和加工的伴侣蛋白及其他相关蛋白的表达水平。我们通过Western blot检测了内质网驻留伴侣蛋白BiP和钙网蛋白的蛋白水平。与相应的GFP转染对照组相比，无论是否经过冬青霉素处理，LRRC8B过表达细胞的BiP蛋白水平均显著升高（图4A、B）。相反，敲低LRRC8B则会导致未经处理和经冬青霉素处理的所有细胞中BiP蛋白水平显著下降（图4A、C）。钙网蛋白的表现则有所不同：在LRRC8B过表达组和LRRC8B敲低组中，其蛋白水平均有上升，但与对应的对照组相比，冬青霉素处理并未进一步增加其蛋白水平（即GFP+冬青霉素组与LRRC8B过表达+冬青霉素组相比，随机序列shRNA+冬青霉素组与LRRC8B shRNA+冬青霉素组相比）（图4D–F）。我们接下来检测了PDI的表达情况，PDI是一种能够催化二硫键形成并辅助蛋白质折叠的分子伴侣（图4D）。在LRRC8B过表达的细胞中，PDI水平较高（图4G，最左侧第1–2根柱状图），而内源性LRRC8B的缺失并未改变PDI的基础表达水平（图4H，最左侧第1–2根柱状图）。与GFP对照组相比，秋水仙霉素进一步提升了LRRC8B过表达细胞中的PDI水平（图4G，第3–4根柱状图），其数值甚至超过了仅由LRRC8B过表达所引发的水平（图4G，第2根与第4根柱状图对比）。相反，在LRRC8B缺失的细胞中，秋水仙霉素并未使PDI表达高于相应的随机siRNA对照组（图4H，最左侧第3–4根柱状图）。这些结果表明，至少在一定程度上，LRRC8B通过促进PDI的上调，提升了细胞在内质网应激条件下的蛋白质折叠能力。下载：下载高分辨率图像（639KB）下载：下载全尺寸图像图4. LRRC8B调控具有细胞保护作用的内质网应激相关蛋白，并促进XBP1 mRNA的剪接A. 显示在不同实验条件下BiP水平的典型Western blot图。B、C. BiP表达的定量分析，结果表明在基础条件及秋水仙霉素处理条件下，LRRC8B过表达都会提升BiP水平，而LRRC8B缺失则会减弱BiP的表达。D. 显示在相应条件下钙网蛋白和PDI的典型Western blot图。E、F. 定量分析显示，无论是在LRRC8B过表达细胞还是缺失细胞中，钙网蛋白水平均有所上升。G、H. 在基础条件及秋水仙霉素处理条件下，分别检测LRRC8B过表达细胞和敲低细胞中PDI的表达水平。I. 经过6小时秋水仙霉素处理后，通过半定量RT-PCR检测到的未剪接XBP1（uXBP1）和已剪接XBP1（XBP1s）mRNA的典型凝胶图像。J. 在基础条件及秋水仙霉素处理条件下，分别检测LRRC8B过表达细胞和敲低细胞中uXBP1和XBP1s的水平。数据为3至6次独立实验的平均值±标准差。统计显著性通过双因素方差分析结合Tukey事后检验来确定。*p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001。在内质网应激状态下，内质网应激传感器IRE1α会处理未剪接的XBP1 mRNA，从而生成有活性的转录因子XBP1s。我们通过过表达或缺失内源性LRRC8B来研究其对XBP1剪接的影响。正如预期，在经过6小时秋水仙霉素处理后，所有组别的XBP1s水平均有所上升（图4I、J）。与相应对照组相比，无论在基础条件还是秋水仙霉素处理条件下，LRRC8B过表达都会提升XBP1s水平。相反，LRRC8B敲低并未影响XBP1的剪接；在未经处理以及经秋水仙霉素处理的细胞中，XBP1s水平与随机siRNA对照组相比均无显著差异。我们还研究了LRRC8B过表达和敲低对ATF4和ATF6表达的影响。在LRRC8B过表达细胞和敲低细胞中，无论在正常状态还是应激状态下，ATF4的表达水平均无显著变化（图S3A–C）。这表明LRRC8B水平的改变可能不会影响内质网应激时的PERK通路。在基础条件及秋水仙霉素处理条件下，与随机对照细胞相比，LRRC8B敲低细胞中的ATF6蛋白水平显著降低，这说明LRRC8B的缺失会损害ATF6通路（图S3D、E）。相反，无论在何种条件下，与GFP对照组相比，LRRC8B过表达均未改变ATF6的表达水平，这表明内源性的LRRC8B已足以维持ATF6信号传导功能（图S3D、F）。3.4. LRRC8B调节细胞内的Ca2+水平LRRC8B是一种定位于内质网的蛋白质，与内质网中的Ca2+向细胞质泄漏有关[28]。众所周知，秋水仙霉素引发的内质网应激会导致Ca2+释放到细胞质中[36]、[37]。我们研究了秋水仙霉素处理对LRRC8B过表达细胞和敲低细胞中细胞质、内质网以及线粒体内Ca2+水平的影响。细胞质中的Ca2+是通过Fluo-4 AM染料来测定的。与预期一致，LRRC8B过表达会显著提升细胞质中的Ca2+水平，而LRRC8B敲低则会导致细胞质Ca2+水平下降。经过秋水仙霉素处理后，LRRC8B过表达细胞中的细胞质Ca2+水平与对照组相当。然而，LRRC8B敲低细胞在经过秋水仙霉素处理后，细胞质Ca2+水平出现显著下降（图5A & B）。内质网中的Ca2+含量则是通过基因编码的内质网Ca2+传感器RCEPIA-1er来检测的。在基础条件下，与对照组相比，LRRC8B过表达细胞的内质网Ca2+含量明显降低；而在秋水仙霉素处理期间，LRRC8B过表达细胞的内质网Ca2+含量则相对较高（图5C、E）。在基础条件下，与随机对照细胞相比，LRRC8B敲低细胞的内质网Ca2+含量略有上升。在两种处理条件下，秋水仙霉素都会进一步降低内质网中的Ca2+水平，但经过秋水仙霉素处理后，LRRC8B敲低细胞与随机对照细胞之间的Ca2+水平并无显著差异（图5D、E）。线粒体中的Ca2+含量则是通过Rhod-2 AM染料来测定的。在未经处理的LRRC8B敲低细胞中，线粒体的基础Ca2+水平已经升高。经过秋水仙霉素处理后，LRRC8B敲低细胞中的线粒体Ca2+水平进一步显著上升。有趣的是，与经过秋水仙霉素处理的对照组细胞相比，LRRC8B过表达细胞中这种由秋水仙霉素引发的线粒体Ca2+升高幅度略低，约为后者的1.6倍（以未经处理的对照细胞为基准），而对照组细胞则升高约2倍，这表明LRRC8B有助于限制Ca2+向线粒体的过度积累，从而发挥保护作用（图5F&G）。下载：下载高分辨率图像（681KB）下载：下载全尺寸图像图5. LRRC8B表达异常的细胞中细胞质、内质网及线粒体内的Ca2+水平A. 携带细胞质Ca2+指示剂Fluo-4 AM的HEK293T细胞在经过或未经过24小时秋水仙霉素处理后的典型图像。B. 每个细胞的Fluo-4荧光强度平均值，并以对照组数值为基准进行标准化。该实验独立重复了三次，每次每组分析200–400个细胞。C、D. 携带GFP标记的LRRC8B（C）或LRRC8B ShRNA（D）以及内质网钙离子红色荧光传感器RCEPIA-1er的HEK293T细胞在经过或未经过24小时秋水仙霉素处理后的典型图像。E. 每个细胞的RCEPIA-1er荧光强度平均值，并以对照组数值为基准进行标准化。该实验独立重复了三次，每次每组分析70–100个细胞。G. 携带线粒体Ca2+指示剂Rhod-2 AM的HEK293T细胞在经过24小时DMSO处理或秋水仙霉素处理后的典型图像。F. 每个细胞的Rhod-2荧光强度平均值，并以对照组数值为基准进行标准化。该实验独立重复了三次，每次每组分析20–40个细胞。数据以平均值±标准差的形式呈现。统计显著性是通过双因素方差分析结合Tukey事后检验来确定的，*p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001。比例尺：20 μm。（关于本图例中颜色对应的含义，读者可参考本文的网页版本。）3.5. LRRC8B减少蛋白质聚集我们使用Thioflavin-T来检测蛋白质聚集情况，这是一种能与蛋白质聚集体结合并在结合后增强荧光的染料[34]。在每种实验条件下，都会对每个孔中的Thioflavin-T荧光强度进行测定。通过秋水仙霉素引发内质网应激来诱导蛋白质聚集。在经过秋水仙霉素处理后，LRRC8B过表达细胞的荧光强度低于其对照组细胞（图6A）。相反，即使在没有秋水仙霉素存在的条件下，LRRC8B缺失细胞也会因蛋白质聚集加剧而表现出更高的荧光强度（图6B）。秋水仙霉素处理并未进一步增加这些细胞中的蛋白质聚集程度。蛋白质聚集是许多神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病的特征性表现。我们在N2a细胞中表达了带有DsRed标签的HTT-83Q，这是一种容易发生错误折叠和聚集的突变型亨廷顿蛋白。对照组则使用不会聚集的HTT-16Q-GFP。我们在LRRC8B过表达和缺失的条件下都表达了HTT-83Q。通过Western blot验证了N2a细胞中LRRC8B的过表达和敲低效果。图6C显示了内源性的LRRC8B条带（约92 kDa）以及与GFP融合的LRRC8B对应的更高分子量条带（约130 kDa）。图6D和E显示，在转染了shRNA的N2a细胞中，LRRC8B蛋白水平显著降低了约50%。有趣的是，与对照组相比，LRRC8B过表达会降低HTT-83Q蛋白水平，而敲低则会使HTT-83Q水平上升约2.5倍，这表明LRRC8B有助于降解错误折叠的HTT-83Q（图6F和G）。共聚焦显微镜观察进一步显示，LRRC8B过表达会减少亨廷顿蛋白聚集体（红色斑点）的数量，而LRRC8B敲低则会显著增加聚集体的形成（图6H–J）。下载：下载高分辨率图像（692KB）下载：下载全尺寸图像图6. LRRC8B减少秋水仙霉素诱发的蛋白质聚集，并抑制HTT-83Q的聚集A. Thioflavin T荧光检测结果显示，HEK293T细胞中LRRC8B过表达可降低秋水仙霉素诱发的蛋白质聚集。B. Thioflavin T荧光分析显示，LRRC8B缺失后会增加蛋白质聚集。C. Western blot分析证实，N2a细胞中成功实现了LRRC8B的过表达。D、E. Western blot检测及定量分析（n = 3），显示shRNA介导的敲低可使N2a细胞中的LRRC8B表达水平降低约50%。F. Western blot分析显示，LRRC8B过表达细胞中的HTT-83Q-DsRed蛋白水平较低，而LRRC8B敲低细胞中的该蛋白水平较高。检测时使用了抗DsRed抗体。G. 三组独立Western blot实验的数据统计结果。H. 共聚焦显微镜图像显示，LRRC8B过表达可抑制HTT-83Q-DsRed聚集体的形成。I. LRRC8B敲低会促进HTT-83Q-DsRed聚集体的形成。J. 使用ImageJ对HTT-83Q聚集体进行定量分析，结果以小提琴图形式呈现。数据以平均值±标准差的形式呈现（n = 3）。统计显著性是通过非配对t检验来确定的。*p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001。比例尺：20 μm；放大视图的比例尺为10 μm。4. 讨论内质网能够维持较高的腔内Ca2+浓度，这一浓度对于蛋白质折叠和信号传导至关重要。这种平衡依赖于Ca2+释放通道（如IP?受体）与肌浆/内质网Ca2+-ATP酶（SERCA）泵的协同作用，同时还有被动性的Ca2+泄漏通道防止Ca2+过度积累[38]、[39]、[40]。此前有研究指出，LRRC8B定位于内质网，并参与内质网Ca2+的泄漏[28]。为明确其功能重要性，我们在内质网应激条件下，研究了LRRC8B在HEK293T细胞和N2a细胞中的过表达及缺失所产生的影响。在接触不同内质网应激诱导因子后，LRRC8B的表达水平上升，而LRRC8A的表达水平则下降。LRRC8B过表达会引发轻微的内质网应激，从而激活适应性UPR信号通路，提高细胞存活率，降低ASK1、TRAF2和CHOP的表达，同时抑制caspase-3的活化。相反，LRRC8B缺失会使细胞对秋水仙霉素诱发的凋亡更为敏感，表现为ASK1、CHOP和Bax水平上升，Bcl-2表达下降，caspase-3的活化以及PARP切割作用增强。此外，LRRC8B的缺失还会影响ATF6通路。LRRC8B在应对内质网应激因子时的上调，很可能反映了它在适应性蛋白质稳态中的作用。LRRC8B过表达会促进XBP1的剪接，同时提升BiP、PDI和钙网蛋白的水平，这表明适应性UPR通路已被激活。这种准备状态似乎有助于细胞应对更高的蛋白质折叠需求，也与细胞在內质网应激条件下更具抵抗力相吻合。抗凋亡信号通路的激活以及caspase活性的降低，说明LRRC8B能调整UPR信号通路，使其朝向促进细胞存活而非诱导凋亡的方向发展。可控的内质网Ca2+释放对于多种信号级联反应而言至关重要[3]、[41]。LRRC8B过表达会显著提升细胞质的基线Ca2+水平，这与内质网Ca2+泄漏增加是一致的。LRRC8B过表达会使更多Ca2+留在内质网中，而在秋水仙霉素处理期间，细胞质中的Ca2+水平则相对较低。LRRC8B缺失则会在基础状态及应激状态下显著降低细胞质中的Ca2+水平，同时大幅升高线粒体中的Ca2+水平。鉴于细胞质Ca2+水平下降和线粒体Ca2+水平上升都与神经元易损性相关[42]，这些发现表明LRRC8B是决定内质网应激条件下Ca2+动态及细胞存活的关键因素。LRRC8B过表达会减少蛋白质聚集，这从Thioflavin-T荧光强度的降低以及N2a细胞中突变型亨廷顿蛋白聚集体数量的减少中可以体现出来。这一现象与BiP水平上升相对应，因为BiP能够促使错误折叠的内质网蛋白解聚[43]，这说明LRRC8B有助于维持蛋白质稳态。相反，LRRC8B敲低会导致BiP表达下降，蛋白质聚集增加，进而引发细胞凋亡，这表明LRRC8B有助于维持适应性UPR功能及蛋白质的正确折叠效率。尽管我们的数据表明Ca2+稳态和适应性UPR信号通路是LRRC8B发挥细胞保护作用的主要机制，但很可能还存在其他作用途径。LRRC8B过表达会降低HTT-83Q聚集体水平（图6F、G），这表明LRRC8B也可能通过蛋白质稳态相关途径及降解途径来促进错误折叠蛋白的清除。此外，LRRC8B过表达细胞中伴侣蛋白及折叠酶（如BiP、钙网蛋白和PDI）水平的上升（图4），也提示它可能对与蛋白质稳态相关的蛋白质的转录和稳定性产生更广泛的间接影响[43]。因此，LRRC8B的保护作用很可能是通过多种相互关联的途径实现的，比如调控Ca2+流动、激活适应性UPR通路以及协助维持蛋白质质量控制功能。未来需要通过靶向降解、转录组学分析及相互作用分析等方法，进一步阐明各途径的相对贡献。LRRC8B既会促进内质网Ca2+泄漏，又能保护细胞免受内质网应激损伤，这一现象看似矛盾，但细胞质、内质网及线粒体中的Ca2+数据支持“预处理模型”的解释。在基础条件下，LRRC8B过表达的细胞中，钙离子泄漏会降低内质网中的Ca2+浓度（图5C、E），同时升高细胞质中的Ca2+浓度（图5A、B），从而引发轻微的内质网应激，促使适应性UPR反应启动，并使BiP、PDI、钙网蛋白和XBP1的水平上升（图3、图4）[3]、[41]。当加入妥布霉素后，这些处于准备状态的细胞仍保持较高的内质网Ca2+浓度（图5E），并限制线粒体中Ca2+浓度的上升（图5F、G）。由于线粒体Ca2+过度积累会触发细胞凋亡，这种限制作用可降低裂解型caspase-3、PARP、ASK1、TRAF2和CHOP的水平，同时提高Bcl-2/Bax的比例（图2、图3）[11]、[15]、[16]。相反，LRRC8B缺失会导致钙离子流入线粒体，进而促进细胞死亡。因此，钙离子泄漏实际上是一种具有保护作用的钙离子转运机制，而非有害因素。综上所述，这些研究结果表明LRRC8B是一种能响应应激的内质网蛋白，它可调节钙离子平衡，促进适应性UPR反应，同时抑制蛋白质聚集。通过这些机制，LRRC8B有助于细胞在应激条件下的存活及蛋白质组的稳定性。鉴于内质网Ca2+失衡和蛋白质稳态功能受损是神经退行性疾病的典型特征[23]、[44]、[45]，LRRC8B的功能异常可能参与这类疾病的发病过程。事实上，LRRC8B的突变已被发现与严重精神疾病相关，这进一步凸显了该蛋白在神经退行性疾病及其他神经系统疾病中的作用潜力[46]。针对LRRC8B或其相关通路进行干预，或许能为应对与内质网应激相关的神经元退化提供新的策略。

4.1 局限性与未来研究方向
虽然本研究明确了LRRC8B在由内质网应激引发的钙离子失衡和蛋白质聚集过程中的功能作用，但仍有许多方面有待深入探索。目前的结论是基于在HEK293T和N2a细胞中进行的过表达实验以及shRNA介导的基因敲低实验得出的；若能采用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除或敲入实验，或是利用原代神经元模型进行研究，将有助于在更接近生理条件的环境中进一步验证这些结论。目前所检测的钙离子浓度涵盖了细胞质、内质网和线粒体这三个区域，而通过使用螯合剂、SERCA抑制剂或IP?R抑制剂等药物进行干预，則能更清晰地阐明钙离子流动的方向及其因果关系。通过免疫荧光技术和共免疫沉淀技术观察到的蛋白质聚集现象，也可借助过滤捕获实验加以进一步验证。将此类研究扩展到体内模型以及与疾病相关的模型系统中，是下一步合理且重要的研究方向。最后，调控钙离子转移效率的内质网与线粒体接触位点的具体组成机制，是一个极具研究价值的科学问题，而本研究的成果也为这一问题的研究提供了依据。

作者贡献说明
N. Raja Mathanki：撰写原始稿件、数据可视化、结果验证、方法设计、实验实施、正式分析、数据整理。
Olivia Neibel Isaac Newton：数据可视化、结果验证、方法设计、实验实施、正式分析、数据整理。
Amal Kanti Bera：文章审阅与编辑、项目管理、资金申请、研究概念构思。

关于写作过程中生成式AI及AI辅助技术的声明
在撰写本文时，作者们使用了ChatGPT工具来提升文本的可读性和语言表达质量。在使用该工具后，作者们对内容进行了必要的审阅和修改，并对最终发表的文章内容承担全部责任。

N. Raja Mathanki | Olivia Neibel Isaac Newton | Amal Kanti Bera
印度泰米尔纳德邦金奈市600036，印度理工学院马德拉斯分校布帕特与乔蒂·梅塔生物科学学院，生物技术系