综述：干细胞生长与分化中的ROS-线粒体相互作用及其在癌症和退行性疾病中的作用

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer》：ROS-mitochondrial nexus in stem cell growth and differentiation and implications in cancer and degenerative diseases

　　摘要：再生细胞，即干细胞，能够在静息状态与活化状态之间转换——静息状态有助于长期存活且代谢活动较低，而活化状态则表现为活跃的增殖和分化，以修复老化或受损的细胞。在干细胞状态转换的同时，线粒体也会发生类似的变化，通过提供能量和生长前体来支持细胞生长。然而，在细胞生长过程中，高水平的线粒体活性会产生活性氧物种（ROS）。ROS作为信号分子，可通过调控关键酶和蛋白质来激活多种代谢途径。在静息状态，即休眠状态下，ROS的产生应受到限制，以防止本不应发生的细胞生长以及细胞内重要成分如DNA的氧化，因为这类细胞的其主要功能就是分裂并将遗传物质传递给子代细胞以实现修复。处于静息状态的大多数干细胞（也称为G0期）由于细胞内的休眠调节因子维持着活跃的线粒体自噬作用，其线粒体活性较低，氧化磷酸化过程也受到抑制。促分裂因子和损伤标志物会激活处于静息或休眠状态的干细胞，使其重新进入细胞周期并开始生长，这一过程需要线粒体提供核苷酸、非必需氨基酸、脂质等多种物质。在线粒体的G1、S和G2/M期，它们会经历与细胞周期相关的结构变化。本文探讨了线粒体如何调控干细胞生长并决定细胞命运。干细胞功能异常会导致再生问题，进而引发早衰和癌症。正如综述结尾所强调的，了解线粒体功能有助于进一步优化癌症和衰老相关的治疗策略。

1. 引言
线粒体是细胞中至关重要的细胞器，能在细胞生理活动中发挥双重作用，根据细胞需求进行调整。在多细胞生物的不同组织和器官中，静息状态的干细胞与已分化的效应细胞之间的线粒体活性存在差异。静息状态的干细胞以及其他具有发育重要意义的细胞，如生殖细胞（卵子和精子），通常具有较低的线粒体活性，其代谢以糖酵解为主，这有助于减少有害的活性氧物种（ROS）的产生，从而实现长期的存活和良好的生理功能[1]。与静息状态相比，准备增殖的干细胞中葡萄糖摄取、糖酵解速率以及线粒体活性都会增加[1]。而大多数已分化细胞的线粒体活性虽较高，但这种高活性虽然有利于高效利用能量和营养物质，却会带来大量ROS的产生，进而导致细胞损伤[2]、[3]。图1总结了静息细胞和生长细胞中的动态变化及代谢情况，强调了由于可逆的线粒体生物发生和自噬作用，线粒体活性所发挥的关键作用[2]、[3]。此外，静息状态的干细胞体积比其活化或分化后的同类细胞更小。在再生过程中，静息状态的干细胞需要被激活才能增殖，体积也会随之增大。活化的干细胞会降低自噬和溶酶体活性，从而使线粒体生物发生加快，生长前体供应增加，进而为细胞复制提供足够的生物量[2]、[3]。生长中的细胞则表现出不同的线粒体形态——椭圆形线粒体在三羧酸循环中效率较高，但在氧化磷酸化过程中的效率较低；而长形线粒体则在呼吸作用、三羧酸循环以及ATP生成方面都更为高效[2]、[3]。这反映出生长中的细胞与已分化细胞或静息状态干细胞在代谢物和能量需求上的差异[2]、[3]。因此，当干细胞从静息状态转变为活化状态，再恢复为静息状态时，其线粒体的功能、结构和动态都会发生可逆的变化。这些转换周期使得线粒体稳态容易因依赖于干细胞的长期功能而出现异常[2]、[3]、[4]、[5]。正如本综述后续部分将阐述的那样，线粒体功能异常往往会导致肿瘤发生以及加速衰老，因为干细胞中的线粒体和细胞缺陷具有遗传性，且能因其在自我更新和促进生长方面的优势而被保留下来。

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图1. 静息状态干细胞（a）与活化状态干细胞（b）中线粒体动态的概览。由于线粒体自噬和分裂作用，静息状态细胞的线粒体体积较小，它们主要依靠糖酵解、糖异生以及脂肪酸氧化来维持生存，具体方式取决于细胞类型以及年龄、疾病等其他因素。此外，静息状态下的线粒体分裂会促进自噬，而细胞生长时的线粒体融合则能防止线粒体降解。活化状态的细胞由于AKT和MYC蛋白的活性，表现出强烈的代谢活动和较高的线粒体活性。处于G1期的细胞则同时具有体积较小和形状较长的线粒体，从而在代谢物生成和能量产生之间取得平衡。

干细胞具有多能性，意味着它们能够在特定器官或组织中生成多种类型的细胞。由于其具备自我更新的能力，干细胞具有很高的再生潜力，也是个体体内寿命最长的体细胞之一，而这种自我更新能力在大多数已分化细胞中并不存在[4]、[5]。长骨骨髓中的造血干细胞（HSCs）能够再生所有髓系和淋巴系血细胞[6]、[7]。肠道上皮隐窝底部的肠干细胞（ISCs）则可以生成所有具有分泌和吸收功能的肠道细胞，每3–4天就能使肠道得到一次更新[4]、[5]。同样，肌肉干细胞（MuSCs）能够生成骨骼肌细胞，而神经干细胞（NSCs）则负责修复受损的神经组织[3]。不过，像内皮细胞和成纤维细胞这样的已分化细胞在增殖时只能生成与其自身相同的类型细胞，无法形成该组织中的多种细胞类型[3]。为进一步阐明线粒体的作用，本文还在相关章节中介绍了部分针对从哺乳动物囊胚内细胞团中分离出的培养胚胎干细胞（ESCs）的研究，以及由已分化细胞诱导产生的诱导多能干细胞（iPSCs）。ESCs和iPSCs共同构成了多能干细胞，它们是研究发育途径的重要工具，也被广泛应用于各种治疗领域，尤其是在再生医学中[8]。处于静息状态的干细胞，如HSCs，主要以糖酵解方式产生能量，从葡萄糖中生成ATP，同时释放乳酸，其线粒体活性极低，这一现象再现了20世纪20年代德国著名生理学家奥托·瓦尔堡在研究增殖中的癌细胞代谢时首次发现的瓦尔堡效应[9]、[10]。近期研究表明，某些干细胞，如肌肉干细胞和神经干细胞，在静息状态下仍会进行脂肪酸氧化，但其线粒体活性较低，因此ROS水平也较低，它们会以酮体作为代谢副产物排出体外[11]、[12]、[13]。静息状态的干细胞并非完全不活跃，它们仍然保持着活跃的细胞机制，这种机制由Wnt/NOTCH/hedgehog信号通路维持，使得它们能够对生长刺激作出反应；否则，像哺乳动物和人类这样的生物体的修复能力和寿命将会大幅下降[14]、[15]。

干细胞的功能主要体现在三个方面：保持低代谢状态、在组织修复时被激活以进行高代谢活动和增殖，以及通过自我更新来维持静息状态下的干细胞池以供未来使用。促分裂信号和损伤标志物（如细胞因子和炎症分子）会增强生长细胞膜上营养转运蛋白的表达和活性，从而提高营养物质的摄取量（见图1左侧）。葡萄糖、谷氨酰胺和脂肪酸等营养物质会在增殖细胞中被重新利用，用于产生能量以及生长前体，这些细胞包括活化的干细胞和癌细胞[16]。这种合成代谢活动既依赖于细胞质中的成分，也依赖于线粒体中的成分。与静息状态相比，增殖细胞对能量和生长前体的需求发生变化，这会引发线粒体的显著改变，即线粒体动态，这种动态是由线粒体生物发生、自噬、分裂和融合等多种过程共同作用的结果[17]、[18]。该领域的研究正在带来重要见解，尤其是关于ROS与线粒体活性之间的关系，以及ROS在干细胞静息状态维持、干细胞活化以及细胞生长和分化过程中的作用[19]、[20]。与神经元和肌纤维这类永远不会重新进入细胞周期的已分化细胞不同，干细胞始终处于可逆的细胞周期停滞状态。那些无法通过凋亡死亡的受损细胞也会被诱导进入永久性的细胞周期停滞状态，这种现象被称为“衰老”，其特征是细胞周期抑制因子的活性上升[3]。如果干细胞不能及时被激活，或者在不适当的时间被意外激活，都会导致再生能力下降、早衰或癌症的发生，进而形成癌干细胞。深入了解干细胞的复杂生物学特性，有助于开发出更好的疗法来应对衰老和癌症问题。本文综述了目前对于线粒体代谢及其所产生的ROS在干细胞维持、活化以及进一步分化过程中所起作用的认知。除了干细胞的功能之外，线粒体以及线粒体产生的ROS还参与决定干细胞的永久性停滞状态，从而导致干细胞失去活性，尤其是在衰老过程中。不过，这一主题超出了本综述的范围，有兴趣的读者可参阅近期关于线粒体作用以及衰老干细胞微环境在干细胞功能中扮演角色的优秀文献[21]、[22]。

2. 干细胞静息-活化过程中ROS的化学性质、特异性及其调控潜力
图2概述了细胞内ROS（单电子氧化剂超氧阴离子O???和双电子氧化剂过氧化氢H?O?）的产生及其作用靶标。ROS是分子氧的未完全还原形式，与细胞代谢，尤其是呼吸作用密切相关。线粒体基质中的复合体I会产生活性氧，而线粒体内膜两侧的复合体III也会产生活性氧。在哺乳动物的呼吸作用中，大约90%的氧气会被消耗用来生成ATP，因此线粒体是ROS的主要来源[23]。定位于内质网和细胞膜等细胞器中的NADPH氧化酶（NOXs1–5）和双氧化酶（DUOX1–2）则是产生ROS的主要酶类[24]。O???和H?O?具有不同的生物靶标，这些靶标在与O???和H?O反应后会发生改变。蛋白质中的Fe-S中心，尤其是4Fe-4S中心，是O???的主要作用靶标。含有O???反应性的4Fe-4S中心是呼吸复合体（I和II）、三羧酸循环中的乌头酸酶和延胡索酸酶以及一碳代谢中的丝氨酸脱水酶的重要组成部分[24]。在会导致O???产生的条件下，大鼠心脏心包中的线粒体，其呼吸相关的Fe-S中心的活性会降低16%，这一降幅远低于乌头酸酶中非氧化型Fe-S中心的77%的活性下降幅度[25]。因此，即使氧化剂如O???的浓度略有上升，由于Fe-S簇会被优先氧化，三羧酸循环中的乌头酸酶活性仍有可能下降，但呼吸作用仍可继续进行[25]。H?O?是一种双电子氧化剂，它会与蛋白质中半胱氨酸残基的巯基发生反应[26]。不过，并非所有蛋白质中的半胱氨酸残基对H?O?的反应活性都相同。半胱氨酸的巯基（-SH）必须先去质子化变为硫醇态（-S-），才能与H?O?发生反应。蛋白质的内部结构，尤其是半胱氨酸附近带正电荷的残基，会显著影响巯基的质子化状态，这使得某些蛋白质（如对巯基有反应性的磷酸酶，例如PTEN、NRF2的伴侣蛋白KEAP1，以及糖酵解相关的甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH，还有含有Fe-S的酶类，如三羧酸循环中的乌头酸酶和延胡索酸酶）对ROS（O???和H?O?）具有很高的反应活性（低Km值，高亲和力），而其他蛋白质则反应活性较低（高Km值，低亲和力），从而在一定的ROS通量下表现出对ROS的特异性[27]、[28]。ROS的氧化作用会抑制PTEN的酶活性，降低KEAP1结合NRF2的能力（即阻止NRF2稳定存在并转移到细胞核中，进而抑制氧化应激相关基因的表达），降低p21这种细胞周期抑制蛋白的活性，同时提高CDK2这种促进细胞周期进展的蛋白的活性，所有这些变化最终都会促使细胞增殖[29]、[30]、[31]。受促分裂因子或生长因子激活的PI3K会将磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2或PtdIns(4,5)P?）磷酸化为磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PIP3或PtdIns(3,4,5)P?）[32]、[33]。细胞膜上的PIP3是AKT的激活位点，未被氧化的PTEN会对其进行去磷酸化处理，从而抵消促分裂因子的作用。因此，ROS的氧化作用以及PTEN被抑制的情况，都会增强促分裂信号的传导[32]、[33]。当受到促分裂信号和ROS的激活后，AKT会直接磷酸化FOXO、GSK3（NRF2、MYC和HIF的抑制剂）以及TSC2（mTORC1的抑制剂）等促进细胞静息状态的因子，使其被降解或失去活性[32]、[33]。活化的AKT通过MYC和mTORC1的作用，会增加营养物质的摄取，提升细胞的代谢速率，还会促进合成代谢过程，比如核苷酸、脂质的合成以及核糖体的生成，从而为蛋白质合成提供原料[16]。

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图2. 细胞内ROS产生的信号传导过程及其相互转化的概览（a）。不同的ROS，即超氧阴离子（O???）和过氧化氢（H?O?），具有不同的作用靶标，具体示例如图（b）和（c）所示。信号ROS中的氧化修饰可依据其稳定性、反应性、流量等因素来定义，这类修饰通常是可逆的，而ROS则起着调节器的作用。处于静息状态的细胞，如HSCs、NSCs、MuSCs、HFSCs和SSCs，会表现出高度保守的生长抑制（或肿瘤抑制）基因——叉头框O家族转录因子、PTEN以及细胞周期抑制剂（如p53调控的p21和FOXO调控的p27）的高活性，这使得这些细胞处于可逆的缓慢增殖但功能完整的状态[34]、[35]、[36]。FOXO还会直接上调人类和小鼠的HSCs、NSCs、MuSCs及ESCs中自噬和线粒体自噬系统的相关成分，以及能够中和ROS的抗氧化酶，如SOD和过氧化氢酶，进而促进细胞静息状态并抑制分化[34]、[35]、[36]。自噬通过避免静息干细胞出现缺陷，并在营养物质运输能力较低时从受损分子和细胞器中回收养分，从而维持干细胞的特性。FOXO可直接上调关键基因的表达，如BNIP3、ATG12、GABARAPL1和LC3B，这些基因能够激活HSCs、MuSCs和NSCs中的自噬与线粒体自噬过程[37]、[38]、[39]。此外，自噬还能加速NSCs中生长受体的分解，降低它们对生长信号的响应能力[39]。因此，FOXO通过主动降解线粒体、诱导抗氧化酶的表达，以及防止基因组等重要组件受到损伤，从而将静息干细胞中的ROS水平维持在较低水平。HSCs和SSCs在静息状态下高度依赖有氧代谢，这一特性得益于缺氧诱导因子所介导的糖酵解促进信号的高活性[40]、[41]。而有研究显示，MuSCs和NSCs在长期静息状态下既会进行有氧代谢，也会发生脂肪酸氧化[12]、[42]。在这两种代谢模式下，干细胞中的氧化磷酸化作用和ROS水平都会下降。同样，较低的ROS水平会提升PTEN、FOXO以及细胞周期抑制剂（如p53、p21、p27、Rb）等维持静息状态的因子的活性[11]、[43]、[44]、[45]、[46]、[47]、[48]、[49]、[50]。实际上，较低的ROS环境有助于从骨髓的微环境中富集并分离出HSC干细胞[51]。无论是由于基因缺失还是氧化作用导致PTEN功能丧失，都会引起HSCs、MuSCs和NSCs的发育异常[52]、[53]、[54]。在癌症中，PTEN肿瘤抑制突变的重要性仅次于致癌性的PI3K突变[55]、[56]。事实上，在许多HSCs、NSCs、MuSCs、精原干细胞和间充质干细胞中，信号ROS通过氧化方式抑制PTEN的活性，对于激活细胞增殖至关重要。如果ROS的产生受到阻碍，比如NOXs和呼吸链复合体（尤其是复合体III）的功能被抑制，就会导致干细胞无法实现更新和再生[40]、[57]、[58]、[59]、[60]、[61]。相反，持续高水平的ROS则会激活静息干细胞使其开始增殖，这会导致干细胞池耗尽，使得干细胞前体无法正常分化，反而增加患癌症（如白血病和胶质母细胞瘤）以及因干细胞池枯竭而引发退行性病变的风险[62]、[63]。极低的ROS水平（约1纳摩尔）能够维持NSCs的干细胞特性，而稍高的ROS水平（约5–10纳摩尔）则会触发生长信号并促进细胞增殖，更高的ROS水平还会促使神经细胞分化。当ROS浓度降至0.1纳摩尔以下时，干细胞就无法被激活以进行增殖和维持组织稳态；而浓度超过100纳摩尔时，则会通过引发脂质过氧化及其他有害作用，对神经细胞造成损伤（更多相关信息可参见相关综述及其中的图4）[23]。要准确测定干细胞在其特定微环境中的ROS实际浓度颇具难度，据推测不同干细胞之间的ROS生理浓度存在差异，细胞外与细胞内的ROS浓度可能存在100倍的差距，细胞内的ROS浓度更低[23]。由于ROS的产生失控（超出信号作用范围，此时ROS的靶向选择性会下降），或是抗氧化防御机制不足，导致高水平的ROS会产生无差别的生物分子反应，使细胞信号传导失去精准性，进而引发毒性、氧化应激、炎症以及其他病理状况。同样，氧阴离子对线粒体酶琥珀酸酶和乌头酸酶的氧化作用会可逆地减缓经典的TCA循环，促使许多癌细胞中柠檬酸积累[64]、[65]。短暂抑制乌头酸酶的活性会导致柠檬酸积累量增加近12倍，相比正常细胞，这会进一步推动HEK293细胞中的脂肪生成和细胞生长[64]、[65]。由于过氧化氢酶1暂时失活导致氧阴离子水平轻度上升，会引发ROS反应，进而促进细胞生物量积累和生长，为许多癌细胞提供生存优势[66]、[67]。需要指出的是，与带电且扩散性和稳定性较差的氧阴离子相比，由过氧化氢酶产生的过氧化氢因其较高的稳定性、中性特征以及良好的扩散性，更适合作为信号传递的ROS分子[68]。不过，氧阴离子虽然反应性较弱，但根据多项研究，它仍能在非常局部的区域内发挥信号分子的作用，尤其是在其生成的线粒体这类细胞器内部[69]。如前文所述，氧阴离子会攻击TCA循环酶以及呼吸链复合体中的Fe-S中心等关键组分[64]、[65]。一般来说，ROS的反应性越弱，就越适合用于信号传递；而ROS的反应性越强，其毒性就越大[27]、[70]、[71]。由于ROS的产生失控或抗氧化防御不足导致的高水平ROS，会引发无差别的生物分子反应，使细胞信号传导失去精准性，进而产生毒性、氧化应激、炎症以及其他病理状况（这类状况多由最具活性和反应性的氧化剂——羟基自由基的无差别反应引发），本文并不对这些内容进行讨论，读者可查阅其他相关文献了解相关信息[72]、[73]、[74]。表1总结了ROS在维持干细胞静息状态以及调控细胞命运中的作用。表1. 各类干细胞和发育细胞（HSCs、MuSCs、NSCs、HFSCs、SSCs以及卵母细胞）中促进细胞静息状态的因子，这些因子会导致线粒体活性、氧化磷酸化作用、ROS水平降低，同时还会促使乳酸或酮体作为代谢终产物被分泌出来。需要注意的是，表中列出的这些因子并非始终存在于所有干细胞中。ROS信号对干细胞静息状态的调控FOXO：高水平的线粒体自噬、抗氧化物质，以及较低的呼吸作用和ROS水平。FOXO还会上调细胞周期抑制剂p27的表达，并抑制环素D的表达。[40]、[56]PTEN：高水平的PTEN会抑制促进细胞生长的AKT-mTOR信号通路。高度磷酸化的AKT会促使FOXO和GSK3被降解（进而激活MYC、NRF2和HIF），同时AKT还会刺激mTORC1等多种促生长因子以及细胞分裂相关因子。[16]、[53]、[54]、[75]、[76]、[77]细胞周期抑制剂（CKIs）（p21、p27、Rb等）：这些抑制剂在深度静息状态的细胞中含量最高，因此不同细胞的静息程度会因所含成分的不同而存在差异。同样，细胞周期激活因子CDK2和环素D的浓度差异也会导致细胞静息状态的异质性。[30]、[78]、[79]低代谢水平：HSCs在静息状态下会进行有氧/无氧糖酵解，线粒体生物合成以及氧化磷酸化作用都会减弱。有研究显示，部分MuSCs、NSCs和HFSCs既能进行有氧糖酵解，也能进行脂肪酸氧化，但氧化磷酸化作用依然较弱。[11]、[43]、[44]、[45]、[46]、[47]、[48]、[49]、[50]多种物种的卵母细胞中，复合体I的结构较为紊乱：较低的ROS水平使得FOXO和PTENl的活性保持较高，从而使卵母细胞处于最为稳定的静息状态。与复合体III和IV不同，复合体I在许多细胞中并非必需，因为它并不参与嘧啶合成等代谢过程。[80]、[81]、[82]、[83]3. 干细胞静息状态与活化状态下的不同线粒体活性与动态变化如下所述，线粒体需发生转变以适应代谢需求，这样才能在接收到合适信号后从静息状态转为生长和增殖状态。处于静息状态的干细胞需要维持较低的ROS水平，因此由于FOXO的调控作用，这类细胞中的线粒体数量通常较少，且呈椭圆形，其嵴结构发育不全，氧化磷酸化效率较低[32]、[33]。当细胞准备开始生长和增殖时，生长信号会激活线粒体生物合成和线粒体延长过程，这些过程是支持合成前体物质以及提升能量产生的必要条件，因此此时ROS水平会上升[32]、[33]。不过，无论是体积较小的线粒体还是延长的线粒体，都具备相同的基质功能，包括以双向模式运行的TCA循环，这些都是增殖细胞的重要特征（相关内容可参见相关综述及参考文献）[84]。在大多数已分化的细胞中，线粒体通常体积更大，彼此之间相互连接，通过融合作用形成，且呼吸效率极高，这是分化细胞的核心特征[85]。不过也有一些分化细胞不符合这一规律，比如内皮细胞主要以糖酵解为主，而成熟的红细胞则没有线粒体，完全依靠糖酵解获取能量[86]。图3总结了线粒体动态变化、ROS产生与能量代谢的主要机制，以及这些机制对细胞静息状态和增殖能力的后续影响。线粒体的大小和形态会随着细胞分解代谢和合成代谢的需求而发生动态变化，尤其是在细胞经历活跃的细胞周期阶段时——即G1-S过渡期、S期以及G2/M期。处于增殖状态的细胞会经历G1期、S期和G2/M期这三个具有不同氧化还原特性的细胞周期阶段，ROS浓度也呈现出梯度变化：G1期的ROS浓度最高，进入S期后逐渐下降，到G2/M期时ROS浓度最低[87]。这种ROS浓度梯度是由多种因素共同作用形成的，其中最主要的原因是线粒体逐渐发生分裂，从而导致呼吸作用减弱，同时由于糖酵解激活因子PFKFB3的调控作用，糖酵解速率会增加[88]。在细胞分裂的中期和后期，线粒体对ATP的需求很高，因为ATP是微管组装和解聚所必需的，而微管的组装和解聚又是染色体排列以及染色体向细胞两极移动所依赖的[89]、[90]。下载：下载高分辨率图片（458KB）下载：下载全尺寸图片图3. 在多能性状态以及细胞生长和分化过程中，线粒体动态变化的差异及其对应的结果。OCT4是一种核心转录因子，仅在生殖细胞和早期胚胎中被激活，这使得基因组能够以时间和空间上受调控的方式被转录因子访问。OCT4的激活对于在培养条件下维持ESCs的未分化状态，以及在体细胞重编程过程中保持ESCs的未分化特性至关重要。激活后的FOXO是调控自噬、糖异生以及能够直接应对ROS的抗氧化酶（如SOD和过氧化氢酶）表达的关键因子，它通过形成正反馈回路来维持较低的ROS水平，进而帮助细胞保持长时间的静息状态。缺氧/假缺氧状态会抑制双加氧酶的活性，并通过HIFs以及DNA和组蛋白去甲基化酶来调控细胞代谢和基因表达。位于图表左侧的促生长因子会促进细胞增殖，而在癌症中这类因子的活性往往不受正常调控，可能处于激活状态也可能被抑制。AKT（PKB）；DRP1，动力蛋白相关蛋白1；FOXO，叉头框O；HIF，缺氧诱导因子；MFF，线粒体分裂因子；MFN，线粒体融合蛋白；mTORC1，雷帕霉素靶点复合物1；MYC，髓系细胞瘤基因；OCT4，八聚体结合转录因子4。线粒体动态变化是调控干细胞在静息状态和活化状态下各种重要功能的基本过程（见图3）。线粒体的转变是由众多相互关联的过程构成的复杂分子网络所驱动的，这一系列过程统称为线粒体动态变化[91]。线粒体动态变化指的是线粒体的融合与分裂、线粒体自噬（即线粒体吞噬作用）以及线粒体生物合成等过程，还包括线粒体的移动以及它们各自承担的功能，比如能量产生、为细胞提供生长所需的前体物质，以及参与细胞内的炎症反应和死亡信号传导。线粒体融合是指两个或多个线粒体结合在一起，从而使线粒体长度增加或形成过度融合的线粒体。这一融合过程由复杂的蛋白质机制调控，其中起关键作用的是线粒体融合蛋白（MFN1和MFN2）以及视神经萎缩蛋白1（OPA1）。MFN1/2蛋白位于线粒体外膜上[92]，而OPA1则位于线粒体内膜上[93]。MFN1、MFN2和OPA1都属于GTP结合蛋白，这类蛋白会随着GTP的结合与水解循环而发生构象变化（相关内容可参见相关综述）[91]。线粒体内膜上的OPAI也是调控线粒体嵴的形成与维持的主要因子，它与其他脂质和蛋白质一起共同作用于维持线粒体膜的曲率[91]。另一方面，线粒体分裂则会导致一个线粒体分裂成多个较小的线粒体，这些较小线粒体的氧化磷酸化能力比延长的线粒体要弱。线粒体分裂同样是由线粒体和细胞质中的多种蛋白质共同构成的复杂网络来实现的，这一过程还得到了内质网与线粒体之间相互作用的促进。在线粒体分裂过程中起关键调控作用的是细胞质中的动力蛋白相关蛋白1（DRP1）及其受体、线粒体分裂因子（MFF）以及线粒体分裂-1蛋白（FIS1）[90]。GTP与DRP1结合后会促使DRP1发生寡聚化，进而赋予其在线粒体分裂以及细胞膜内吞过程中所需的裂解功能[94]、[95]、[96]。MFF能够选择性地招募已经寡聚化的DRP1[97]。缺乏线粒体分裂促进蛋白DRP1和FIS1的细胞，其线粒体会出现极度延长的现象。与裂变不同，少数线粒体分裂过程也会导致内质网和高尔基体等细胞器的管状结构形成[98]。线粒体的裂变与融合会显著改变细胞质中的Ca2+浓度，进而影响依赖Ca2+的信号传导过程（详见综述）[91]。线粒体嵴是负责ATP合成的结构，其具有高度动态性，这种动态性由线粒体与内质网之间的特定蛋白-蛋白相互作用所调控，这类相互作用被称为线粒体-内质网接触点（MERCs）。MERCs是能够促进线粒体与内质网之间的接触以及线粒体裂变和融合的蛋白质微结构域[90]。通常情况下，融合通过增加并紧密排列线粒体嵴来提高线粒体氧化磷酸化效率，同时还能防止线粒体自噬。而裂变则会促进自噬，并在细胞分裂时帮助将线粒体分配到子细胞中[99]、[100]。需要指出的是，线粒体嵴的生成与线粒体的融合和裂变其实是相互独立的过程，即便在同一线粒体中，不同嵴的膜电位也并不均匀，且各自承担着不同的功能与作用[101]、[102]。由于高度保守的叉头框O（FOXO）转录因子的持续作用以及缺氧诱导因子（HIF）信号通路所导致的线粒体生成减少，线粒体会处于高度碎片化状态且数量较少，这就使得氧化磷酸化作用减弱，产生的活性氧也较少[40]、[57]、[58]、[59]、[60]、[61]。在许多物种中，处于静息状态的卵母细胞会保持其线粒体中的复合体I处于无序状态，以此避免活性氧的产生；否则过高的活性氧水平会引发过早的卵子发育过程[80]、[103]。静息状态的干细胞和卵母细胞由于呼吸作用较弱，产生的活性氧也少，因此能维持一种高度还原性的环境，此时NADH和NADPH的浓度相对其氧化形式NAD+和NADP+而言要高，这有利于FOXO、HIF、PTEN和OCT4等维持静息状态和多能性的因子充分发挥作用[40]、[57]、[58]、[59]、[60]、[61]、[80]、[103]。

4. 活性氧对干细胞中线粒体动态及钙信号传导的调控
活性氧会直接或通过降低GSH水平的方式，显著影响线粒体裂变和融合的多个环节（见图3）[100]、[104]。线粒体是活性氧产生的主要场所，而这些活性氧会严重损害线粒体DNA，因为线粒体DNA相比细胞核中与组蛋白及非组蛋白结合的基因组DNA，保护机制更为薄弱。值得注意的是，活性氧会氧化促进融合的蛋白质MFN2上的Cys684位点，从而增强MFN2的聚合作用，促进线粒体融合，提升呼吸效率，进而减少活性氧的产生[100]、[104]。高浓度的氧化型谷胱甘肽（GS-SG）也会促进MFN2的氧化以及线粒体融合[100]。如前文所述，延长的线粒体可以通过更高密度的线粒体嵴来提升氧化磷酸化效率。而碎片化的线粒体则无法高效进行氧化磷酸化反应，电子泄漏现象更严重，产生的活性氧也更多[100]、[104]。此外，通过对线粒体嵴的超微成像观察可以发现，同一线粒体中不同嵴的腔内膜电位存在差异，且各自承担着不同的功能[102]。通过抑制对细胞生长至关重要的嘧啶合成途径，也就是通过阻断与复合体III相关的二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）的活性，可以增加融合蛋白MFN1和MFN2的量，促使线粒体延长，进而提升复合体III的效率，试图恢复DHODH的活性，为细胞提供足够的核苷酸前体[105]。

在成体干细胞以及其他具有发育重要意义的细胞中，线粒体动态表现出很大差异。哺乳动物卵母细胞的线粒体数量可能最多，但由于其刻意保持复合体I处于无序状态并阻止活性氧产生，因此呼吸效率较低[106]。同样，源自早期胚胎内细胞团（ICM）的初始胚胎干细胞也表现为呼吸作用弱、产生的活性氧少，这是因为它们的线粒体体积较小、呈碎片化状态，且大多为椭圆形，主要功能是在三羧酸循环中参与代谢物的转化[18]、[107]、[108]。哺乳动物卵母细胞和初始胚胎干细胞具有较高的线粒体膜电位，多能性标志物OCT4、SOX2和NANOG的表达水平也很高，同时核质比例也较高，这一特征与未分化的成体干细胞如造血干细胞、神经干细胞和肝干细胞相似[109]。在哺乳动物胚胎干细胞中，这些多能性标志物表达水平很高，但它们会受到活性氧的氧化作用而受到抑制，从而导致胚胎干细胞分化并最终耗竭，尤其是在活性氧水平较高的环境下[110]。像胚胎干细胞和卵母细胞这类表达OCT4的发育细胞含有较高水平的抗氧化剂，这些抗氧化剂能够维持OCT4处于活跃的、未被氧化的状态[110]。OCT4转录因子是一种先锋转录因子，它能结合到其他转录因子无法触及的染色质上，从而维持卵母细胞、受精卵、囊胚胚泡以及胚胎干细胞的基因组表达，这对维持全能性和多能性至关重要[107]。随着细胞分化，OCT4的表达会完全停止，在哺乳动物胚胎的胃胚期之后也不会再有表达。在将体细胞重编程为诱导多能干细胞的过程中，OCT4的异位表达起着关键作用[107]。在初始胚胎干细胞中，OCT4会使线粒体保持碎片化状态，或者正是碎片化的线粒体才维持了OCT4的活性；这一点目前尚不完全清楚。不过，这种线粒体状态与从受精卵到囊胚的早期胚胎发育过程高度契合[107]。此外，初始胚胎干细胞中线粒体增殖相关标志物的表达水平也较低，比如线粒体DNA拷贝数、线粒体DNA聚合酶以及线粒体转录因子A（TFAM）的活性都较低[111]。

虽然细胞中主要的钙离子储存库是内质网，但线粒体与内质网微结构域之间的接触点（即线粒体-内质网接触点，MERCs）处发生的线粒体裂变和融合，会显著调节细胞质中的钙离子浓度以及钙离子相关的信号传导过程[91]。事实上，线粒体动态会显著改变细胞质中的钙离子浓度，进而影响干细胞的功能。与碎片化的线粒体相比，延长的线粒体更易于吸收钙离子，这使得细胞质中的钙离子浓度降低，或是能够缓冲过高的细胞质钙离子水平[112]。稳定或延长的线粒体能够吸收多余的细胞质钙离子，从而导致细胞质中的钙离子浓度下降，但线粒体内的钙离子浓度却会上升[91]。延长的线粒体更倾向于进行氧化磷酸化反应，而这种反应本质上依赖于乙酰辅酶A在三羧酸循环的氧化方向上的高效流动，从而为氧化磷酸化反应生成NADH。在哺乳动物细胞中，线粒体内钙离子浓度的上升会提升氧化磷酸化反应的强度以及活性氧的产生量[113]。从机制上来看，钙离子会刺激PDH磷酸酶（PDP）的活性，该酶会去磷酸化并激活丙酮酸脱氢酶，进而增加丙酮酸向乙酰辅酶A的转化。三羧酸循环中的脱氢酶，包括异柠檬酸脱氢酶（IDHs）和α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH），也会在线粒体钙离子浓度上升时被直接激活[114]、[115]。相反，线粒体裂变则会导致细胞质中的钙离子浓度上升[116]。因此，线粒体的裂变与融合能够分别调控线粒体及其周围细胞质中的钙离子浓度，进而影响相关的钙离子信号传导。

多项研究表明，通过线粒体融合降低细胞质中的钙离子浓度，对于胚胎干细胞、神经干细胞和造血干细胞等多能干细胞的分化过程至关重要[117]、[118]、[119]、[120]。在小鼠心脏胚胎干细胞中，较低的钙离子浓度可以通过阻止钙离子从细胞外进入细胞质，从而抑制促进多能性的NOTCH信号通路，为心肌细胞的分化创造条件[117]。这项研究指出，钙离子、钙调神经磷酸酶以及NOTCH1信号通路在心肌细胞分化过程中发挥着关键作用[117]。还有多项研究证实，线粒体融合带来的细胞质钙离子浓度下降，对胚胎干细胞、神经干细胞和造血干细胞的分化具有不可或缺的作用[117]、[118]、[119]、[120]。较高的钙离子浓度会激活延长型线粒体中的多种酶，如丙酮酸脱氢酶（PDH）、异柠檬酸脱氢酶（IDH）和α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH），进而推动经典的三羧酸循环（乙酰辅酶A的氧化）进行，同时支持氧化磷酸化反应，而这正是大多数已分化细胞的主要代谢模式[113]。此外，少数线粒体对钙离子的选择性吸收可能会引发自噬或细胞凋亡，具体取决于钙离子释放的幅度和持续时间（详见综述）[91]。

5. 线粒体活性氧在促进细胞生长中的作用与机制
在线粒体的代谢功能中，它兼具两种相反的方向的作用：一方面有助于生物量的生成，但这一作用与细胞的呼吸作用呈反比。三羧酸循环通过氧化乙酰辅酶A来发挥作用，这一循环被称为经典循环，它能持续为氧化磷酸化反应提供NADH，从而支持氧化磷酸化过程的进行。另一种称为还原性三羧酸循环（或非经典循环）的代谢途径，则在HIF、假性缺氧以及活性氧信号的调控下反向运作，主要通过谷氨酰胺（经α-酮戊二酸）或葡萄糖衍生的丙酮酸经丙酮酸羧化酶的作用生成草酰乙酸[29]、[121]。随后草酰乙酸会与丙酮酸衍生的乙酰辅酶A结合形成柠檬酸。因此，葡萄糖和谷氨酰胺都具有很强的回补作用，能够帮助增殖细胞生成生长所需的物质前体[121]。在细胞生长过程中，由于线粒体活性增强而产生的活性氧会氧化KEAP1，进而激活氧化还原调控主转录因子NRF2，后者会促使GSH以及能够消耗GSH的抗氧化酶的从头合成增加[122]。NRF2的活化对于维持氧化还原平衡以及细胞增殖过程中所需的代谢重编程具有至关重要的作用[123]。如果NRF2的活性过低，会导致造血干细胞、神经干细胞等干细胞的功能衰退；而其活性过高则会促进肿瘤的发展，进而引发包括白血病和胶质母细胞瘤在内的多种癌症[124]、[125]。那些同时存在碎片化线粒体和延长型线粒体的生长中的细胞，能够以可控的方式平衡活性氧、ATP以及各种代谢产物的生成，具体机制将在后文中详细阐述。活性氧会氧化一些关键的酶和转录因子，从而促进细胞的生长以及氧化还原信号传导，而各类代谢产物则有助于支持细胞的生长以及表观基因组的调控（见图4）。

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图4. 细胞生长需要不同来源的活性氧、活性氧介导的生长信号传导（左侧显示）以及它们所具备的代谢重编程潜力（右侧展示）。线粒体在合成代谢中的作用，即支持分裂细胞中的细胞质量增加（见图左侧）。末端为钝头的箭头表示抑制作用。复合体I仅在线粒体基质中产生活性氧，而复合体III则在线粒体基质以及膜间隙都会产生活性氧。处于信号传导范围内的活性氧可充当“变阻器”，用于调节细胞的能量供应以及生物量的积累。线粒体呼吸链以及三羧酸循环中的多个酶类对活性氧的产生以及氧化反应都具有很高的敏感性。在细胞正常的氧化还原环境中，活性氧的形成与响应大多是短暂且可逆的。ACLY和DHODH以及一些脂质生成酶，在癌症治疗领域备受关注。ACLY即ATP-柠檬酸裂解酶；CAT为过氧化氢酶；DHODH为二氢乳清酸脱氢酶；GPX为谷胱甘肽过氧化物酶；KEAP1为凯尔奇样ECH相关蛋白1；NRF2为核因子红细胞2相关因子2；PC为丙酮酸羧化酶；PDH为丙酮酸脱氢酶；PI3K为磷脂酰肌醇3-激酶；PTEN为磷酸酶和张力蛋白同源物；SOD为超氧化物歧化酶；α-KG为α-酮戊二酸；β-TRCP为含β-转导素重复序列的蛋白。

5.1. 线粒体活性氧可增强促增殖信号（AKT信号）
在生长中的细胞中，无论是由促增殖因子激活的氮氧化物合酶产生的活性氧，还是线粒体自身产生的活性氧，都会通过抑制维持细胞静息状态的磷酸酶PTEN，从而增强促增殖信号传导[126]、[127]、[128]。活性氧会可逆地氧化Cys124位点，进而抑制PTEN的活性，这使得由促增殖因子激活的PI3K能够不受阻碍地发挥作用，进而激活AKT蛋白[129]。活性氧会增强AKT激酶（也称为蛋白激酶B，PKB）的活性，该酶通过激活雷帕霉素靶蛋白复合物I（mTORC1）、MYC以及NRF2，来促进细胞的生长，进而推动蛋白质、脂质和核酸的合成。AKT的磷酸化还会降解一些维持细胞静息状态的因子，比如FOXO、GSK3和TSC2（见图4左侧）[16]。活性氧会抑制多种糖酵解相关酶（如GADPH和PKM2）以及三羧酸循环中的酶（如苹果酸脱氢酶和延胡索酸酶），在许多干细胞被激活的过程中，这些酶的作用会使得代谢物从分解代谢途径转向合成代谢途径[130]、[131]。活性氧对糖酵解酶的抑制还会使糖酵解中间产物进入戊糖磷酸途径（PPP），进而生成核糖-5-磷酸（核苷酸中的一种糖类）以及NADPH，这两种物质对于维持细胞质中的还原性（合成代谢）和抗氧化反应至关重要[132]、[133]。在人类皮肤细胞中，让细胞暴露在低毒浓度的过氧化氢环境中15分钟，就可以抑制GADPH和PKM2的活性，减缓糖酵解速度，同时提升PPP途径中NADPH的生成量[134]。总体而言，癌细胞会表现出更强的将葡萄糖导入PPP途径以及一碳代谢途径的倾向。由于转录调控异常，衰老细胞中GADPH的活性会升高，这往往会导致神经干细胞陷入深度静息状态，进而影响神经细胞的生成[135]、[136]。尽管在许多癌症中，能够调控糖酵解中间产物走向氧化代谢途径和合成代谢途径的PKM2亚型表达水平很高，但最新研究表明，它在成年动物的神经干细胞以及神经前体干细胞中对于神经细胞的生成也具有重要作用[137]。此外，降低PKM2的活性会削弱造血干细胞中的糖酵解重编程能力，抑制造血干细胞的增殖，但不会影响其静息状态[138]。关于其他类型的干细胞是否也能通过活性氧信号传导以及糖酵解重编程途径发生功能重编程，目前的相关研究还比较有限。活性氧会抑制那些含有巯基和Fe-S中心的呼吸链复合体以及三羧酸循环中的酶类，这些酶类原本是过氧阴离子和过氧化氢的攻击目标，活性氧的抑制作用会暂时阻止代谢物的氧化，反而促使这些代谢物在生长中的细胞中走合成代谢途径[132]、[133]。这种代谢重编程正是多种癌症生长背后的主要机制[132]、[133]。截至目前，人们已经发现了线粒体中至少11到12个活性氧的产生位点，其中复合体I和复合体III是活性氧产生的主要来源[139]、[140]。需要注意的是，线粒体产生的ROS已知会氧化PKM2，但ROS的内源性来源及相关机制——GADPH的氧化——仍存在争议，尽管GADPH的氧化反应极为敏感，且与磷酸酶的氧化反应相当[141]、[142]。要弄清NOXs和线粒体产生的ROS在代谢重编程中的具体作用颇具挑战性，但这有助于改进癌症的治疗策略。积累的TCA循环中间产物，如琥珀酸和ROS，还会抑制缺氧诱导因子（HIF；HIF1α和HIF2α）的调节蛋白脯氨酰羟化酶结构域蛋白（PHD1、PHD2和PHD3），从而形成伪缺氧状态[32]、[33]。PHDs需要氧气（以及α-酮戊二酸）才能对HIFs进行羟基化处理，并通过含有VHL的E3连接酶将其降解。由于氧气供应不足导致的PHD功能抑制，即缺氧状态（氧气浓度为0.5–1%），会促使HIFαs（即HIF1α、HIF2α以及研究较少的HIF3α）被激活，这些蛋白会通过转录方式上调细胞内的葡萄糖转运蛋白（GLUTs）以及所有糖酵解酶的表达。HIFs还会转录上调丙酮酸脱氢酶激酶（PDKs），后者通过抑制丙酮酸脱氢酶（PDH）来阻止丙酮酸在线粒体中的氧化，进而降低细胞的氧化代谢水平。增加PDH的活性，比如通过减弱HIF信号传导，可提升乙酰辅酶A向CO?的氧化程度，减少干细胞中的生长前体物质，从而导致干细胞增殖、自我更新和再生能力受损[143]。ROS信号传导还会促进AKT转移到线粒体中，在那里它既会激活PDK又会抑制PDK，进而推动细胞增殖[144]。有趣的是，针对线粒体的抗氧化剂能够减少线粒体内的ROS以及AKT进入线粒体，进而抑制细胞生长并阻碍心肌细胞的分化[144]。

5.2 线粒体的合成代谢支持作用
线粒体在生成生长前体物质方面起着关键作用（见图4）。研究表明，核苷酸的供应、作为脂质合成前体物质的柠檬酸以及通过草酰乙酸参与蛋白质合成的天冬氨酸，再加上氧气，都是限制细胞生长的因素，而ATP和NADPH的供应则总是过剩的[145]。嘧啶合成途径中的末端酶DHODH，其正常功能依赖于功能正常的呼吸链复合物III和IV（但不依赖复合物I或II），这些复合物能够氧化辅酶Q以供DHODH使用[146]。无论通过何种方式抑制DHODH，包括使用复合物III和IV的抑制剂，都会导致细胞增殖停止（相关综述可见）[147]。此外，由于复合物I被抑制而在线粒体中积累的NADH，可以通过线粒体内膜上的烟酰胺核苷酸转氢酶（NNT）和线粒体基质中的NAD激酶（NADK2）的共同作用，转化为线粒体内的还原型NADPH[148]、[149]。NNT和NADK功能缺失会阻碍细胞增殖，而其过度活跃则会促进肿瘤发生[148]、[149]。细胞质中的NADPH则由磷酸戊糖途径、苹果酸酶以及异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）维持，而线粒体的还原潜力则主要依靠IDH2、IDH3、NNT和NADK2来维持[148]、[149]、[150]。线粒体还通过调控琥珀酰辅酶A的生成与转运，为细胞提供血红素前体物质[145]。线粒体产生的柠檬酸不仅能通过促进脂质合成来推动HSCs、NSCs及其他干细胞的生长，还能通过染色质乙酰化作用（详见下文）提升诸如乙酰辅酶A羧化酶和脂肪酸合成酶等促进生长基因的表达水平[41]、[151]、[152]。

5.3 ROS-线粒体轴在表观基因组重排调控中的作用
成年静息状态下的干细胞中异染色质含量较高，仅允许那些对维持静息状态至关重要的基因进行基础水平的转录[2]。与处于增殖状态的干细胞相比，静息干细胞中的翻译活动也较为低下[2]。与染色质乙酰化类似，DNA去甲基化以及某些组蛋白标记（H3K9me和H3K27me）的去修饰，也能增加染色质的开放程度，从而有利于那些对干细胞增殖至关重要的基因表达[153]、[154]。这种更为开放的染色质状态正是癌细胞的典型特征。TCA循环中的代谢物，如乙酰辅酶A和α-酮戊二酸，是染色质乙酰转移酶和去甲基化酶的重要底物。而琥珀酸和柠檬酸则是α-酮戊二酸依赖型去甲基化酶的竞争性抑制剂。由于发育过程中基因表达和抑制作用的差异，为了实现染色质的重排，线粒体与处于增殖和分化状态下的细胞核紧密相连[155]。此外，在哺乳动物成熟卵母细胞和受精卵的线粒体及细胞核中，许多线粒体酶，如PDH、柠檬酸合酶、IDH、乌头酸酶、α-KGDH、琥珀酸脱氢酶（SDH）以及延胡索酸水合酶（FH），都高度集中[155]。柠檬酸还会在调控染色质乙酰化和甲基化的核质区域产生乙酰辅酶A和α-酮戊二酸这两种表观遗传学相关物质，而这些物质对于干细胞从静息状态向活化状态及分化状态的转变至关重要[41]、[152]。线粒体呼吸作用能够调控细胞内的NAD+/NADH比例以及组蛋白去乙酰化酶（HDACs）的活性。ROS可可逆地抑制TCA循环中的乌头酸酶，以及在较小程度上抑制α-KGDH，从而导致琥珀酸和柠檬酸的积累，进而改变染色质的甲基化状态[156]、[157]、[158]。需要指出的是，由于每种酶对其底物的亲和力各不相同，表观遗传学相关酶对α-酮戊二酸和琥珀酸这类竞争性代谢物的反应程度也存在差异（相关综述可见）[159]。例如，癌细胞通常表现为整体DNA低甲基化，但某些特定基因位点的组蛋白却呈现高甲基化状态[160]、[161]。胚胎干细胞同样具有DNA低甲基化的特征，源自滋养外胚层的胎盘组织也是如此。TCA循环中的SDH、FH和IDH酶发生突变也会引发多种类型的癌症，而这主要归因于表观基因组的紊乱（相关综述可见）[159]。不出所料，参与表观遗传调控的酶发生突变同样会导致癌症的发生[160]、[161]。正因如此，琥珀酸这类α-酮戊二酸类似物，以及L-2HG（2-羟基戊二酸的L异构体）和D-2HG等其他代谢物，由于其能够促使细胞保持高度增殖的状态，因此被称为“致癌代谢物”。抑制复合物III的功能会导致调节性T细胞（Treg）中琥珀酸和2-羟基戊二酸的积累，进而显著影响表观基因组的重塑过程[162]。琥珀酸和2-羟基戊二酸会抑制DNA去甲基化酶的活性，从而导致DNA甲基化程度上升，并通过激活或抑制基因转录的方式来改变基因的表达模式[162]。

6 ROS与线粒体动态在细胞周期及细胞周期停滞中的作用
由于不同细胞周期阶段线粒体的活性存在差异，细胞周期的各个阶段也表现出不同的氧化还原特性（见图5）[87]。在G1期，线粒体呈现椭圆形或长条状形态，它们既为细胞提供生长前体物质，又供给能量，从而满足分裂细胞在合成代谢和氧化代谢方面的双重需求[163]。除了在G1期促进细胞生长外，ROS以及线粒体相关机制在S期和G2/M期完成细胞周期的过程中也发挥着关键作用。在G1期末，ROS的氧化作用达到峰值，它既能激活关键的细胞周期启动因子CDK2，又能使细胞周期抑制剂p21失活，进而有助于推动细胞从G1期进入S期[30]、[128]。在G1期，升高的ROS水平会氧化并使p21失活，从而促进细胞周期的进展；而在G2/M期，由于ROS水平较低，p21不会被氧化，这就会导致细胞前体细胞停止增殖，进而根据其他信号通路的作用要么走向分化，要么继续自我更新[31]。此外，在S期由于线粒体分裂加剧，线粒体的体积会变小，这也有利于它们在分裂细胞中被分配到各个子细胞中[163]。在G2/M期，CDK1与周期蛋白B会磷酸化DRP1的Ser585和Ser616位点，使其定向移动到线粒体表面，从而在细胞有丝分裂期间促进线粒体分裂，进而使线粒体能够传递给子细胞[164]。当细胞进入S期开始DNA复制时，就需要降低ROS水平，因为ROS可能对正在复制的裸露DNA造成损伤[88]。在S期开始时，由AKT-mTOR途径的磷酸化作用激活的E3连接酶APC/CCDH1会启动DNA复制，而在细胞周期的后续阶段，则必须通过CDH1磷酸酶的脱磷酸化作用使DNA复制酶失活[88]。在S期及细胞周期的后续阶段，随着ROS水平的逐渐下降，CDH1磷酸酶的活性也会逐步上升[88]。活性的CDH1会降解那些在细胞周期中起关键作用的成分，比如在S期与CDK2一起工作、在G2/M期与CDK1一起工作的周期蛋白A，从而导致细胞分裂出现缺陷并停滞。由于CDH1还能降解糖酵解促进因子PFKFB3，它的失活还会使得在S期及细胞周期的其余时间内，糖酵解作用相对于氧化磷酸化作用更为活跃。与S期以及G2/M期的ROS水平相比，细胞在G1期的ROS水平略高，只有那些对ROS敏感的关键蛋白才会表现出活性。蛋白质组学分析表明，细胞周期过程中ROS水平的变化虽然幅度很小，但也足以调控那些对ROS亲和力较高的细胞成分[31]。

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图5. G1期和G2/M期线粒体动态的差异：G1期ROS水平较高，而G2/M期ROS水平较低，这一差异促进了亲代细胞在G1期末的细胞周期进展，同时导致子细胞出现细胞周期停滞，进而引发后续的自我更新和分化。在G1期末ROS水平达到峰值，它会通过激活细胞周期启动因子CDK2并抑制细胞周期抑制剂p21，直接推动细胞分裂。当细胞进入S期后，线粒体呼吸作用减弱，ROS水平随之下降，以此保护正在复制的DNA免受损伤。因此，在细胞有丝分裂开始时ROS水平最低，而细胞周期抑制剂p21也会从氧化抑制状态中恢复过来，这一因素最终决定了细胞前体细胞是会进入另一轮细胞分裂还是走向分化，具体取决于其他分子信号的组合。如果将ROS水平降低到低于启动细胞周期所需的阈值，就会破坏HSCs、SSCs、ESCs和ISCs的自我更新和分化能力[165]、[166]、[167]、[168]。那些APC/CDH1和p21活性较高的子细胞会阻止细胞周期的进一步进展，从而进入细胞周期停滞状态，进而促进细胞分化[31]。细胞周期停滞是细胞分化或干细胞更新的前提条件。稳定的APC/CCDH1还会通过降解促进细胞有丝分裂的因子，如CDC20和周期蛋白A，以及抑制分化的蛋白质，如ID2和SnoN（也称为SKIL样蛋白），来促进细胞分化[88]、[169]、[170]。那些APC/CDC20活性较高且p21活性较低的细胞可能会启动另一轮细胞分裂。高水平的CDC2活性会促进前列腺癌的发展，并使细胞呈现出类癌干细胞的特征[171]。E3连接酶组分APC在与CDH1结合时具有肿瘤抑制作用，而与CDC2结合时则具有致癌作用[172]。

7 ROS-线粒体轴在细胞分化中的作用
线粒体产生的ROS对于驱动HSCs和静息T细胞的分化至关重要，而低线粒体活性下的糖酵解状态则有利于这些细胞的增殖（相关综述可见）[173]。通过增强氧化磷酸化作用来提高ROS水平，可以促进肠道干细胞和毛囊干细胞的分化[46]、[174]、[175]。如前文所述，ISCs中较高的ROS水平会促使它们向吸收细胞分化，而由于ISCs中NOX1基因的表达减少而导致ROS水平降低，则会使ISCs以牺牲吸收型结肠细胞为代价向分泌细胞分化[167]、[176]。通过单细胞RNA测序技术对LGR5+ ISC的分化路径进行重建后发现，诱导LGR5+ ISC的线粒体分裂并降低其ROS水平，会促使它们向糖酵解型分泌细胞（即潘氏细胞、杯状细胞和神经内分泌细胞）分化[177]。在小鼠海马体中，那些ROS水平最高的神经前体细胞在经历体力活动后会迅速增殖并分化[178]。较高的线粒体ROS水平会促进胚胎干细胞的分化并加速其耗竭，这一现象可通过激活小鼠胚胎干细胞中的线粒体氧化磷酸化作用得到证实[179]。PDH的活性会受到HIF上调以及AKT激活的PDK的抑制，而PDH则会被PDH磷酸酶（PDPs；PDP1和PDP2）激活。PDP功能的异常会激活线粒体中的PDH和氧化磷酸化作用，从而导致多能性胚胎干细胞中的ROS水平上升。胚胎干细胞中ROS水平升高会妨碍心肌细胞的分化[179]。在多能性糖酵解型iPSCs中，较高的线粒体活性和ROS水平会促使它们向类胶质细胞分化[180]。线粒体通过调控嘧啶物质的流动，对DNA复制的速度以及细胞周期的推进起着至关重要的作用，这一特性在早期哺乳动物胚胎的卵裂过程中尤为明显[181]。在早期胚胎细胞中，如果核苷酸供应不足，DNA复制速度就会显著减慢，这就为从囊胚阶段开始的细胞形态构建提供了足够的时间[181]。在人类和小鼠的HSCs中，核苷酸的缺乏也会使DNA复制停滞，从而为细胞命运的转换和分化争取时间[181]。目前，干细胞中的DNA复制机制仍有待进一步深入研究。

8 干细胞、癌症和衰老过程中的线粒体功能紊乱
线粒体产生的物质（表观遗传学相关底物和ROS）与表观基因组的调控或紊乱之间存在密切联系，而这种调控或紊乱又会进一步影响干细胞的功能和命运。老化后的造血干细胞倾向于向髓系分化，这不仅会增加淀粉样癌的发病风险，还会因淋巴细胞谱系的逐渐丧失而严重削弱免疫功能。这种分化倾向通常被归因于老化导致的线粒体功能障碍[182]。老化造血干细胞中的线粒体往往高度延长，形成丝状结构，从而增加氧化磷酸化反应及相应的活性氧生成，为造血干细胞的信号传导提供条件，进而提高患淀粉样癌和淋巴系癌症的风险[183]。老化造血干细胞中功能有缺陷的线粒体会产生异常的代谢物，如乙酰辅酶A、乳酸、NAD+、α-酮戊二酸及其类似物（琥珀酸、延胡索酸和2-羟基戊二酸），这些代谢物会通过乙酰化和甲基化作用改变表观基因组状态——乙酰化受乙酰辅酶A和NAD+调控，而甲基化则由α-酮戊二酸、其类似物以及一碳代谢产物S-腺苷甲硫氨酸调控[153]、[184]、[185]。异常的表观基因组代谢物会促使转录因子出现病理性活性，导致干细胞激活减弱或增殖加剧、分化紊乱[22]。这种表观基因组失调会随着年龄增长在处于静息状态的造血干细胞中引发表观基因漂变，改变造血干细胞群的结构，使得造血干细胞自我更新能力下降，更易向髓系分化，进而增加患髓系白血病的风险。老年人的血液系统疾病发病率显著更高[186]。需要指出的是，髓系分化是造血干细胞的默认分化路径，而淋巴系分化则需要基因表达上的额外调控。不出所料，当造血干细胞失去精细调控能力时，首先出现的便是淋巴系分化的衰退[184]、[185]。尽管造血干细胞分化偏倚的确切机制仍不完全清楚，但近期研究指出线粒体融合蛋白MFN2和氧化磷酸化反应在老化造血干细胞的髓系分化偏倚中起着关键作用[183]。在老化小鼠中敲除MFN2可显著减少线粒体的延长现象——这一老化造血干细胞的典型特征，同时恢复线粒体自噬作用，降低静息状态下老化小鼠造血干细胞中的氧化磷酸化反应和活性氧水平，改善造血干细胞功能，并逆转髓系分化偏倚[183]。间充质干细胞的循环速度较慢，且其表观基因组处于更为开放的状态，这在很多方面与脑癌中的胶质母细胞瘤相似[187]、[188]。老化后的肌肉间充质干细胞会在干细胞特异性基因上出现抑制性标记，同时在具有增殖功能的基因上出现染色质乙酰化水平升高的现象，这会导致肌肉间充质干细胞的特性逐渐丧失，且随着年龄增长，由于储备干细胞的活化程度增加，肌肉间充质干细胞的数量也会减少[189]、[190]。肌肉再生能力下降是老年人常见的特征。衰老干细胞中线粒体活性增强，导致乙酰辅酶A和活性氧水平升高，这两种物质会抑制包括造血干细胞、间充质干细胞和肌肉间充质干细胞在内的多种干细胞中的保守静息状态调控因子FOXO和PTEN，从而降低干细胞的静息状态维持能力[33]。代谢异常，比如乳酸代谢紊乱，会将正常环境转变为具有致癌可能的肿瘤微环境，甚至可能使周围的正常细胞发生肿瘤化[191]。除了代谢物引发的表观基因组改变外，线粒体代谢紊乱导致的嘧啶类和血红素等生长前体的生成增加，也会独立于氧化磷酸化反应和活性氧介导的信号传导途径促进癌症发生[192]。线粒体通过STING通路在炎症调节中发挥关键作用，当受损线粒体中的线粒体DNA释放到细胞质中时，该通路就会被激活[193]。STING信号传导对造血干细胞的功能调控至关重要，其激活往往会改变髓系细胞的生成，进而诱发髓系癌症，同时减少淋巴系前体的数量[194]。干细胞的可塑性虽然对组织的修复和再生至关重要，但也存在引发癌症的风险。黑色素瘤细胞的迁移和转移往往与调控黑色素细胞前体迁移和定位的胚胎机制出现紊乱有关[195]。代谢状况以及线粒体活性会极大影响细胞的肿瘤转化，尤其是那些具有可逆生长趋势的细胞，比如干细胞、B细胞、T细胞和肝细胞[33]。由于线粒体参与活性氧信号传导和生长前体的生成，它们成为癌症治疗中的理想靶点。暂时降低线粒体SOD的活性会导致过氧化氢水平轻微上升，进而促进细胞生物量的积累和细胞生长，为许多癌细胞提供生存优势[67]。许多癌细胞会模仿干细胞的特点，通常起源于细胞微环境中类似干细胞的生态位转变，这类转变会导致胶质瘤和肝癌的发生[196]、[197]、[198]、[199]。与活化的干细胞类似，癌症干细胞也会表现出活性氧信号传导增强、磷酸化蛋白磷酸酶途径活性升高以及类似沃伯格效应的代谢模式，这些特征有助于细胞快速增殖，同时癌细胞还会增强谷氨酰胺代谢和脂质生物合成能力，以确保自身存活[200]、[201]。最新研究显示，在癌症的转移病灶中也存在高比例的癌症干细胞[202]。受篇幅限制，有兴趣了解各类癌症中与代谢相关、包括线粒体相关脆弱点和治疗靶点的更多内容，可参考其他优秀的学术文章[203]、[204]。在衰老过程中，由于线粒体功能障碍日益严重以及活性氧水平不断升高，氧化还原平衡会被打破，这往往会导致DNA氧化，形成7,8-二氢-8-氧代鸟嘌呤（8-氧代G），该物质会氧化并抑制核内的SIRT1（一种依赖NAD+的去乙酰化酶）以及COMPASS甲基转移酶MLL1（KMT2A）[205]。染色质中的8-氧代G会成为多种氧化还原调控转录因子的聚集位点，其中包括AP-1，这些转录因子会激活与抗氧化反应和细胞稳态相关的多个基因[29]、[206]。COMPASS甲基转移酶和多梳抑制复合物2（PRC2）甲基转移酶都属于多亚基结构的表观基因组修饰因子，它们由多种酶和调控成分组成，在多细胞生物中具有高度保守性。在造血干细胞、肌肉间充质干细胞和间充质干细胞的发育和功能维持过程中，这两种修饰因子会相互调控，共同控制细胞的谱系形成和分化过程[207]。在癌症中，由于表观基因组修饰的底物或酶活性发生变化，这两种修饰复合物常常会出现功能失调，因此它们也成为白血病、胶质母细胞瘤和肝癌治疗中的潜在靶点[207]、[208]、[209]。老化干细胞染色质中8-氧代G的积累会改变表观基因组结构，且在多种老化干细胞中观察到的表观基因漂变现象中起着关键作用[210]、[211]。8-氧代G也是衰老过程中的重要分子机制，研究这些机制有望为促进健康老龄化提供新的思路[210]。有研究表明，线粒体围绕细胞核分布的位置可能会进一步影响基因组中的8-氧代G标记以及表观基因组的响应情况[212]。线粒体DNA中的氧化标记8-氧代G会导致间充质干细胞向星形胶质细胞方向分化，进而抑制神经细胞的生成[213]。升高的活性氧水平会通过线粒体DNA损伤以及淀粉样β42寡聚体的形成，促使从人类诱导多能干细胞衍生的间充质干细胞向星形胶质细胞谱系分化[214]。在胚胎发育过程以及成年后的组织再生过程中，线粒体活性氧以及线粒体代谢物都会对表观基因组产生影响，这是当前重要的研究领域，有助于我们更好地理解人类出生前和出生后的健康风险。9. 干细胞及其线粒体在疗法中的应用造血干细胞是用于移植治疗的优质健康线粒体来源。将线粒体或整个造血干细胞移植到受损组织中，已被证明能够显著促进组织修复，因此在治疗线粒体脑病、肌少症以及辅助胃肠道伤口愈合方面具有巨大潜力[215]、[216]、[217]。有研究提出，可将造血干细胞及其线粒体作为前药，用于脑部疾病和视网膜缺血的临床前模型研究[218]。将老化的小鼠造血干细胞转移到年轻小鼠的骨组织中，可以使其恢复活力，提升其重新构建正常组织的能力[219]。不过，这些经过处理的造血干细胞仍然存在向髓系分化的倾向，这也是衰老的典型特征，这一倾向会大大降低它们生成淋巴系（免疫）细胞的能力[220]。负责产生精子的精原干细胞依赖于NOXs产生的活性氧，如果活性氧信号传导出现异常，就会导致精子生成障碍和不孕症[40]。由于线粒体在嘧啶合成过程中起着关键作用，它们也成为最早被用于癌症治疗的靶点之一[221]、[222]、[223]。布雷奎纳这种强效的DHODH抑制剂与平衡型核苷转运体抑制剂双嘧达莫联合使用，可为一些难以治疗的实体瘤提供一种潜在的抗癌方案[224]。尽管目前针对线粒体分裂和融合的机制已经开展了大量研究，但该领域仍缺少一些关键环节，尤其是在理解细胞在应对压力和能量需求时线粒体动态变化的调控机制方面[90]。活性氧会在线粒体膜上引发脂质过氧化反应，这一反应是细胞色素c释放到细胞质中的关键步骤，同时也会调控细胞凋亡信号通路。因此，为了维持细胞的正常功能，必须严格调控活性氧的水平，活性氧水平过高或过低都会对干细胞的功能造成损害。由于技术限制，目前还无法准确预测和量化活性氧的水平。10. 结论与展望由于抗氧化能力下降，高水平的氧化应激会攻击线粒体的多个组成部分，包括线粒体膜。过量的活性氧已不再具有选择性，线粒体膜的氧化或过氧化会导致缺陷，进而释放出能够诱导细胞凋亡的细胞色素c，而细胞色素c的正常功能是将呼吸链中的电子从复合体III传递到复合体IV。此外，线粒体DNA没有像基因组DNA那样的保护性蛋白质包裹，因此更容易受到损伤和断裂，进而通过STING通路引发炎症信号传导。尽管人们对活性氧信号传导已有较为深入的了解，但如何界定正常的信号传导水平与具有破坏性的活性氧水平之间的界限，目前仍不清楚，这一问题的研究往往受到活性氧检测限以及可用于研究的干细胞数量有限的限制。在体内更准确地检测活性氧，同时在不产生任何干扰因素的情况下重现干细胞的正常功能，仍是该领域面临的主要挑战，也是未来的重要研究方向。解决这些问题有助于我们更深入地了解干细胞生物学、癌症生物学以及活性氧生物学，进而通过先进的癌症和退行性疾病治疗方法，提升人类的健康水平。Mohd Javed Akhtar|Sudhir Panwar