《Biomedicine & Pharmacotherapy》：FUS-driven zebrafish model of ALS identifies tribenzylamine as a candidate modulator of ALS-associated pathology
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肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种进行性神经退行性疾病，以运动神经元丢失和运动功能下降为特征；然而，有效的治疗方法仍然有限。为了支持无偏倚的治疗发现，研究人员旨在开发一种基于转基因斑马鱼模型的高通量表型筛选平台，该模型表达人ALS相关的FUS-R521C突变体（
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种进行性神经退行性疾病，以运动神经元丢失和运动功能下降为特征；然而，有效的治疗方法仍然有限。为了支持无偏倚的治疗发现，研究人员旨在开发一种基于转基因斑马鱼模型的高通量表型筛选平台，该模型表达人ALS相关的FUS-R521C突变体（mtFUS）。该模型使用改良的QF-based二元表达系统生成，并表现出早发性病理特征，包括升高的氧化应激、进行性神经元变性和运动活动受损，从而再现了FUS相关ALS的关键方面。转录组分析揭示了与患者来源运动神经元中报道的相似分子特征，包括失调的神经活性配体-受体信号（neuroactive ligand–receptor signaling）、免疫激活和应激反应通路改变。使用该平台，研究人员鉴定出三苄胺（TBA）作为一种候选化合物，可改善运动表现并显著降低活性氧（ROS）水平。整合的转录组和生化分析表明，TBA诱导协调的分子变化，包括神经元活动相关基因表达的正常化、免疫和代谢通路的调节以及激素相关信号的恢复。TBA逆转了FUS诱导的关键神经元活性性类固醇（包括雌激素和孕酮）的减少，并增加了雌激素反应基因的表达，表明神经元活性性类固醇稳态的部分恢复。这些发现支持mtFUS斑马鱼模型作为ALS药物发现的有用平台，并确定TBA为ALS相关表型的候选调节剂，其作用与转录组重塑和神经元活性性类固醇信号相关。
**论文解读：FUS驱动的ALS斑马鱼模型鉴定三苄胺为ALS相关病理的候选调节剂**
**研究背景与问题**
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致命的神经退行性疾病，以运动神经元进行性丢失和运动功能下降为特征，最终导致肌肉无力、瘫痪和呼吸衰竭。目前获批的治疗药物（如利鲁唑、依达拉奉和针对SOD1的反义寡核苷酸托夫生）仅能提供有限的或亚型特异性的生存获益，提示现有疗法远不能满足临床需求。ALS具有显著的遗传和病理异质性，其中FUS基因突变与早发性、快速进展的ALS密切相关。FUS是一种RNA结合蛋白，参与转录调控、RNA剪接和mRNA转运；ALS相关FUS突变损害核输入，导致细胞质聚集、应激颗粒形成和聚集，进而通过功能丧失和毒性功能获得机制致病。尽管已有多种FUS动物模型（如小鼠敲除、敲入和过表达模型），但许多模型需要较长时间才发展出表型，且维护成本高、可扩展性低，限制了其在高通量药物筛选中的应用。因此，开发一种早期、可量化、可扩展的体内ALS模型对于无偏倚表型药物发现至关重要。
**研究开展与结论**
研究人员利用改良的QF-based二元表达系统（源自Neurospora crassa），在斑马鱼中实现了神经元特异性过表达人FUS-R521C突变体（mtFUS），建立了早发性ALS模型。该模型在幼虫早期（5天受精后，dpf）即表现出氧化应激升高、神经元退行性变和运动功能受损，并在转录组水平重现了患者来源运动神经元的关键分子特征，包括神经活性配体-受体信号失调、免疫激活和应激反应通路改变。基于该模型，研究人员对约300种生物活性化合物进行了行为学表型筛选，鉴定出三苄胺（TBA）作为候选化合物，能够显著改善运动表现并降低活性氧（ROS）水平。进一步整合转录组学和生化分析表明，TBA诱导了广泛的分子变化，包括神经元活动相关基因表达正常化、免疫和代谢通路调节以及激素相关信号恢复。TBA逆转了FUS诱导的神经活性性类固醇（如雌激素和孕酮）水平降低，并增加了雌激素反应基因表达，提示其部分恢复了神经活性性类固醇稳态。该研究发表在《Biomedicine》上，证明mtFUS斑马鱼模型可作为ALS药物发现的有效平台，并确定TBA为ALS相关表型的候选调节剂，其作用与转录组重塑和神经活性性类固醇信号相关。
**主要关键技术方法**
研究人员采用改良的QF-based二元表达系统（QF-QUAS系统），构建神经元特异性启动子HuC驱动的QFDBD-2xAD-VP16驱动线，以及13×QUAS上游的ZsGreen-p2a-hFUS-R521C效应线，通过显微注射和转座酶介导整合建立稳定转基因斑马鱼品系。表型筛选基于DanioVision系统进行幼虫自发运动和光-暗转换行为分析，Z-factor为0.52。化合物处理从2 dpf开始，以10 μM浓度进行筛选，TBA以1–10 μM进行剂量-效应评估。转录组分析采用全幼虫批量RNA测序（bulk RNA-seq）和神经元特异性RNA测序（通过FACS分选ZsGreen?神经元，约300只幼虫/条件），使用Illumina平台测序，数据经Hisat2比对、StringTie定量，edgeR进行差异表达分析（|FC|≥2，p<0.05）。神经活性性类固醇水平通过超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）定量。所有样本来自韩国大学动物实验中心，实验经Korea University Institutional Animal Care and Use Committee批准（KOREA-2023-0176）。
**研究结果**
**3.1 过表达mtFUS诱导神经元死亡和早期死亡**
通过Kaplan-Meier生存曲线和TUNEL染色发现，mtFUS斑马鱼平均寿命约13 dpf，在5 dpf时背侧脊髓出现TUNEL?凋亡细胞（主要位于感觉神经元区域，非运动神经元），至10 dpf时脊髓广泛出现TUNEL?细胞，且与运动神经元标志物Mnx1共定位，表明mtFUS过表达先引起中间神经元凋亡，随后导致运动神经元死亡。
**3.2 过表达mtFUS引起早期运动缺陷**
利用DanioVision系统进行自发运动、惊吓反应和光-暗转换行为分析，发现mtFUS幼虫在5 dpf时运动距离显著减少，对机械刺激的反应距离降低但反应潜伏期正常，光-暗转换中暗期运动峰值下降且耐力减退，提示运动功能障碍而视觉刺激感知保留。脊髓运动轴突长度和神经肌肉接头（NMJ）在5 dpf时无显著差异，表明早期运动缺陷主要源于中枢神经系统功能异常而非外周突触损伤。
**3.3 依达拉奉治疗短暂降低氧化应激但未恢复运动**
CellROX试剂检测显示，mtFUS幼虫在5 dpf时背侧脊髓和脑干区域ROS水平升高。依达拉奉（10 μM）处理1天后ROS减少，但3天后ROS水平回升至未处理水平，且5 dpf时运动距离未改善，提示单独降低氧化应激不足以逆转行为表型。
**3.4 mtFUS幼虫转录组分析揭示ALS相关分子特征**
批量RNA-seq鉴定出400个上调基因和248个下调基因（|log?FC|≥2，BH-adjusted p<0.1）。GO富集显示上调基因主要富集于免疫应答、刺激感知、防御反应和炎症反应；细胞组分和分子功能富集于膜相关受体信号，如G蛋白偶联受体活性。KEGG分析显示神经活性配体-受体相互作用和激素信号通路显著富集。火山图显示神经元受体基因（如chrnb2l、grm6a）下调，免疫/应激基因（如mhc1zfa、ccl19b、hmox1a）上调。RT-qPCR验证了代表性基因变化。神经元特异性RNA-seq（FACS分选ZsGreen?神经元）也发现神经活性配体-受体通路富集，并鉴定出凋亡和细胞黏附通路变化，与FUS突变患者运动神经元转录组特征一致。
**3.5 TBA通过多层次转录组谱改善ALS相关表型**
表型筛选鉴定TBA为候选化合物。TBA处理（2 dpf起，10 μM）显著改善5 dpf时mtFUS幼虫的运动距离，并降低ROS水平。TBA处理后的转录组分析显示，差异表达基因在GO生物过程中富集于刺激-应答通路和代谢过程（如糖代谢、胰岛素样生长因子受体信号）。细胞周期相关基因（如haus4、exo1）下调，免疫调节（socs3a、irf7）、代谢（ucp3、igfbp1a）和神经元活动（npas4a、fosab）基因上调。惊吓反应实验中，TBA显著增加机械刺激后的运动距离。KEGG分析显示TBA处理富集了神经活性配体-受体相互作用、激素信号、类固醇生物合成通路。雌激素反应基因（如vtg3、egr2a）在mtFUS幼虫中下调，TBA处理使其表达向对照水平恢复，提示TBA增强雌激素相关信号。
**3.6 TBA提高mtFUS模型中神经活性性类固醇水平**
LC-MS/MS定量分析显示，与对照相比，mtFUS幼虫的17β-雌二醇、孕酮、5α-二氢孕酮和别孕烯醇酮水平显著降低。TBA处理使这些神经活性性类固醇水平恢复至近似对照水平。选择性雌激素受体激动剂己烯雌酚（hexestrol）处理仅部分增加惊吓反应距离，但未改善整体运动。雌激素受体拮抗剂氟维司群（fulvestrant）与TBA共处理显著减弱TBA对运动功能的改善，表明TBA的效应部分依赖于活性雌激素受体信号。
**讨论与结论**
讨论部分指出，mtFUS模型再现了ALS关键病理特征，包括早期背侧脊髓中间神经元凋亡先于运动神经元死亡，这与SOD1、TDP-43和C9ORF72小鼠模型及ALS患者中的早期中间神经元损伤一致。该模型在5 dpf时即出现运动缺陷且NMJ结构正常，提示中枢神经系统功能障碍是早期运动下降的主要原因。依达拉奉仅短暂降低ROS而未改善运动，表明仅抗氧化不足以逆转表型。TBA作为来自啤酒花（Humulus lupulus）的天然化合物，其改善运动、降低ROS和调节神经活性性类固醇的作用提示多条通路参与。雌激素信号部分介导了TBA效应，但己烯雌酚不完全复制TBA效果，表明TBA可能通过多靶点机制发挥作用。研究结论部分翻译如下：在本研究中，研究人员建立了一个HuC:mtFUS斑马鱼模型，该模型再现了FUS相关ALS的多个病理、功能和转录组特征，同时具有快速发病、神经元特异性和可扩展性。该模型可实现高通量表型筛选，可能为早期药物发现提供有用平台。利用该系统，研究人员鉴定出TBA作为候选调节剂，可改善HuC:mtFUS幼虫的运动功能并降低氧化应激。TBA处理与协调的转录组变化和神经活性性类固醇水平升高相关，提示神经内分泌失调可能参与该模型中FUS相关ALS表型。这些发现共同支持表型筛选作为有用的发现策略，并确定TBA为待进一步研究的候选化合物，特别是通过定义其直接靶点、神经活性性类固醇相关通路的因果作用、表型改善的持久性以及在独立ALS模型中的疗效。
