基于斑马鱼的高分辨率表型筛选鉴定中枢神经系统轴突直径的调节因子

《PLOS Biology》：A high-resolution phenotypic screen identifies regulators of CNS axon diameter in zebrafish

　　

调控神经元形态发生的分子机制尚待完全阐明。在模式系统中开展发现性筛选是揭示生物学过程分子基础的有力手段。在此，研究人员采用斑马鱼来鉴定调控中枢神经系统轴突直径的分子。轴突直径差异可达100倍以上，较大轴突表现出更快的传导速度。轴突直径影响髓鞘形成，可被动态调节，并在疾病中发生改变。然而，由于体内轴突尺寸微小且结构复杂，深入了解轴突直径一直具有挑战性。因此，研究人员开发了一个自动化高分辨率活体成像与分析筛选平台，以鉴定斑马鱼大型Mauthner轴突直径的 pharmac（药理）调节因子。研究人员筛选了880种化合物，鉴定出33个命中（hit）化合物。验证该流程后，研究人员确认影响β-2 adrenoceptor（肾上腺素受体）和多巴胺信号通路的化合物可增加轴突直径。这代表了首个基于亚细胞体内成像的、检测轴突直径变化的筛选，为研究这一神经元形态关键特征的生物学提供了切入点。

论文解读文章如下：

该研究发表于《PLOS Biology》。目前，决定和调控体内细胞形态与功能复杂性的机制尚待完全理解，尤其是脊椎动物中枢神经系统神经元巨大的多样性与复杂性调控机制仍不完整。尽管在果蝇、线虫和斑马鱼等模式生物中开展的表型发现筛选已揭示了轴突导向、神经支配和突触形成所需的因子，但神经元形态的其他特征如轴突形状特别是轴突直径的控制理解相对有限。脊椎神经系统轴突直径差异超100倍，约0.1 μm至数十微米，横截面积差约10,000倍，伴随约100倍的动作电位传导速度差异，且直径可沿单个轴突变化并可被细胞间相互作用、髓鞘胶质细胞信号及神经元活动动态调节，在多种疾病与损伤中亦发生改变。然而，由于在完整系统或回路中可视化轴突直径多样性及动态变化存在困难，且现有高分辨率成像如电子显微镜和超分辨成像难以规模化用于发现性筛选，轴突直径生长的分子机制（主要涉及轴突细胞骨架与轴突大小的关联）仍大多不明确。此前研究人员建立斑马鱼作为研究轴突直径的模型，利用转基因报告基因观察体内轴突直径生长，并从髓鞘化轴突形成的遗传筛选中鉴定出核转运受体ipo13对大轴突直径生长至关重要，这促使研究人员开发专门识别轴突直径新型调节因子的发现平台。

研究人员开展了一项基于斑马鱼的大型化学化合物发现筛选，利用自动化高分辨率活体成像与机器学习分析流程，以大型Mauthner轴突为模型，筛选880种LOPAC12??化合物，最终鉴定出33种可改变轴突直径的命中化合物，并验证了β-2肾上腺素受体激动剂与多巴胺拮抗剂可增加Mauthner轴突直径生长，首次实现了基于亚细胞体内成像的轴突直径变化检测筛选。

主要关键技术方法包括：使用转基因斑马鱼品系Tg(hspGFF62A:Gal4); Tg(UAS:GFP)标记Mauthner轴突，样本为野生型或nacre^?/?背景的5 dpf（days post-fertilization，受精后天数）幼虫；采用脊椎动物自动化筛选技术（VAST）耦合转盘共聚焦显微镜（SDCM）进行自动化高分辨率活体成像，优化20×物镜单z栈参数；建立基于随机森林像素分类的多级机器学习（ML）自动图像分析流程（使用Arivis Vision4D及Python脚本聚类排序），结合Definiens DeveloperXD测量轴突直径；利用z-score标准化化合物效应并排除影响整体体型（体长与面积变化阈值分别为2.5%与3%）及技术误差的化合物；对命中化合物使用不同供应商同源物及高分辨Airyscan FAST共聚焦成像（Zeiss LSM880）进行验证，并分析神经元多区室形态。

研究结果如下：

自动化高分辨率成像的体内轴突直径测量使用斑马鱼幼虫。研究人员选择Mauthner神经元及其轴突作为模型，其位于延髓，投射长的大直径轴突沿脊髓驱动运动输出，在2至5 dpf直径从约1 μm长至约5 μm。为适配规模化发现筛选，平衡高分辨率与高通量，测试10×与20×物镜及全动物或特定区域成像协议，确定20×放大倍率下单z栈为最优参数。应用mTor抑制剂雷帕霉素（50 μM，3至5 dpf）可检测到Mauthner轴突直径减少约10%，且0.5% DMSO不影响直径而1% DMSO显著减小直径，证实该成像参数可检测轴突直径的实验性诱导变化。

创建亚细胞分辨率测量轴突直径变化的自动图像分析流程。针对转基因线标记伴生的异位荧光、自体荧光、皮肤色素及批次变异导致图像质量异质性与轴突轨迹不固定问题，采用Arivis Vision4D的多级随机森林像素分类：先以高斯模糊原始数据训练低分辨率模型排除皮肤肌肉伪影与无关信号，再以原始数据训练高分辨率模型紧密分割候选轴突对象；通过Python脚本在z维聚类排序区分靠近物镜的“顶部”轴突；导出顶部Mauthner轴突逐片二进制掩膜并Z投影为2D平面掩膜，多边形化后沿检测轴突长度取多重骨架宽度测量平均宽度。该流程与两名实验者手动评估比较，虽绝对测量值有差异但均能检测到nefma^tg/+系中约20%的轴突直径显著减小，证明流程足够灵敏。

化学筛选揭示改变Mauthner轴突直径的化合物。使用LOPAC12??库（880种化合物，初筛浓度10 μM，致死则重筛2 μM），3至5 dpf处理，5 dpf成像分析。每化合物3孔每孔3鱼（n≈9）伴0.5% DMSO同板同批次对照，计算相对于对照的z-score（阈值±1.2定义命中）。初筛排除致死（3.18%）、技术困难（17.5%，如z轴漂移、假检测、n<4），653种未达阈值，45种为命中（约5%）。进一步通过明场图像机器学习测量体长与面积，排除10种改变整体体型（>2.5%长度或>3%面积）的化合物（其与轴突直径变化显著相关R2=0.72/0.69，剩余33种无相关R2=0.02/0.01）。最终33种命中（18种减小、15种增大直径），19种关联神经传递与离子通道功能，经Student t检验18种显著改变直径，提供社区资源。

验证命中化合物揭示β-2-肾上腺素受体激动剂与多巴胺拮抗剂增加Mauthner轴突直径生长。依据z-score、效应量、作用类别重复性及拮抗/激动对立效应优先验证肾上腺素受体（2拮抗减、1激动增）与多巴胺信号（2拮抗增）相关化合物。订购不同供应商同源物或同通路化合物做剂量反应（1至100 μM，排除毒性浓度），用高分辨共聚焦（40× Airyscan FAST）半自动测量。验证显示β-2肾上腺素受体激动剂Formoterol在4 μM（约增8%）及原LOPAC12??化合物10 μM（约增11%）显著增加直径；另一激动剂Fenoterol hydrobromide在1和4 μM显著增加（约8%至9%）；α-肾上腺素受体拮抗剂Fenspiride hydrochloride未重现减小。多巴胺拮抗剂Domperidone与Eticlopride均显著增加约6%至10%。该两类化合物未在小直径后侧线神经（PLLn）轴突中达显著改变但有Formoterol趋势增加（约70 nm，8%）。

命中化合物对不同神经元区室呈现复杂影响。用膜标记转基因Tg(hspGFF62A:Gal4); Tg(UAS:mem-Scarlet)背侧视成像延髓Mauthner神经元，测试Formoterol（4 μM）与Domperidone（20 μM）对胞体、树突、轴突起始段（AIS）及近端轴突的影响。Formoterol显著增加Mauthner胞体体积，树突面积长度无变，AIS直径长度无变，近端轴突直径有增加趋势。Domperidone轻微但显著降低胞体体积，树突与AIS无变，但近端轴突直径增22%。表明化合物对神经元各形态区室影响具复杂性。

讨论部分总结：斑马鱼是强大的体内发现筛选模型，结合生物传感器、报告基因、成像与分析创新可研究此前难解的过程。本研究将可扩展高分辨高内涵斑马鱼成像用于轴突直径生物学——这一被忽视但对神经元形态与神经回路功能至关重要的特征。技术考量在于平衡亚细胞形态参数（如轴突直径）变化筛查所需的分辨率与成像时间，选用Mauthner轴突（5 dpf约5 μm直径）适配自动共聚焦筛选系统（VAST-SDCM，XY像素0.286 μm）。未来需扩展筛选理解轴突直径与神经元形态其他特征关系，评估更小轴突需提升显微灵敏度与分辨率（验证用Airyscan FAST XY像素0.054 μm），且需高效数据处理流程（本筛查约10,000栈，原单站约15分钟/栈，专用hub降至5分钟/栈）。需注意假阳性/阴性：效应量受限（3至5 dpf Mauthner直径仅增约1.5 μm，排除影响整体生长化合物）、个体间轴突直径变异约±10%需足够n（目标9，因技术排除17.5%致部分n<9）、化合物浓度偏差与板效应对体内剂量反应非线性。验证流程确认多巴胺信号与肾上腺素受体化合物影响轴突直径。生物学考量：D2多巴胺受体拮抗剂Domperidone与Eticlopride增直径，多巴胺能神经元调制Mauthner介导逃逸反应，神经元活动可能影响轴突直径（体外海马高频刺激轴突局部增宽），但Dompericard致轴突增大同时胞体减小，需深入解析多巴胺信号下轴突直径与细胞生长调控机制及整体神经元形态效应。β-2肾上腺素受体激动剂Formoterol与Fenoterol hydrobromide增直径，该受体为GPCR介导儿茶酚胺激活影响生理与行为及平滑肌舒张血管舒张；其与多巴胺化合物不同，呈神经元大小普遍增加（胞体与轴突及侧线神经趋势），可能影响的通用神经元生长通路。本研究为首次致力发现轴突直径生长的分子基础，后续需在CNS与PNS不同大小轴突及不同成熟阶段表征化合物效应，通过遗传扰动互补解析机制（需时空条件操作，斑马鱼可行），并拓展至哺乳动物及人类模型。筛选结果为社区提供基础与资源以促进轴突直径生物学理解。

研究结论部分翻译：研究人员验证了两类命中——β-2肾上腺素受体激动剂与多巴胺拮抗剂——影响Mauthner轴突直径生长。筛选成功识别轴突直径相对微小变化的事实，例证了利用斑马鱼进行体内筛选以识别细胞形态亚细胞特征调节因子的可能性。